熊膽精制液儲存中的質(zhì)量穩(wěn)定性研究

韓秋偉，張曉旭

（1.黑龍江林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.中山大學(xué)藥學(xué)院）

熊，食肉目，是屬于熊科的雜食性大型哺乳類，以肉食為主，別名黑瞎子。種類較少，全世界僅有7種，我國有3種：馬來熊、棕熊、黑熊。熊，全身都是寶，其中以熊膽最有價值。黑熊為國家二級保護(hù)動物，為保護(hù)野生熊資源，近幾年養(yǎng)熊采膽技術(shù)得到了很快的發(fā)展。

熊膽粉是熊科動物黑熊經(jīng)膽囊手術(shù)引流膽汁的干燥品。

熊膽作為中國四大動物藥材之首，入藥已有幾千年歷史，素有“藥中黃金”之美譽(yù)?！侗静菥V目》載：熊膽味苦、性寒，歸肝膽心經(jīng)，無毒，能清熱、平肝、利膽、明目、殺蟲?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)：熊膽具有清熱解毒、抑菌抗炎、保肝護(hù)肝、利膽溶石、降脂降壓、鎮(zhèn)咳平喘、去翳明目、抗疲勞等多方面的藥理功能，尤其是治療膽囊炎、膽結(jié)石更是功效獨(dú)特。

熊膽主含牛黃熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸、膽酸，多與牛黃酸或甘氨酸等形式結(jié)合膽汁酸而存在，另含膽固醇、膽紅素及無機(jī)鹽等。根據(jù)熊膽具有的藥理作用，目前熊膽制劑發(fā)展的迅速。從簡單的直接應(yīng)用熊膽粉入藥，發(fā)展到利用精制熊膽粉入藥的階段。精制熊膽粉是除去熊膽粉中蛋白質(zhì)和粘液質(zhì)、膽汁酸等雜質(zhì)，對制備液體制劑，保證顏色、氣味、澄明度、避免不良反應(yīng)發(fā)生等質(zhì)量問題得到了保證。為了適應(yīng)大生產(chǎn)，需要批量生產(chǎn)精制液。本文重點(diǎn)研究精制液的冷凍儲存的質(zhì)量穩(wěn)定性。

1 儀器與試藥

美國先德公司生產(chǎn)的PC－2000高效液相色譜儀、SSI－3000紫外檢測器、ST－400柱溫箱、10μL微量進(jìn)樣器、減壓干燥器、SB－3200型超聲波清洗器、ADS－135型十萬分之一分析天平、JYP－2架盤天平。

?；切苋パ跄懰釋φ掌罚ㄓ兄袊幤飞镏破窓z定所提供，供含量測定用，批號110816－200906）、沈陽華東生產(chǎn)的色譜級甲醇、磷酸二氫鈉、0.45μm有機(jī)濾膜、水為重蒸餾水。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇－磷酸二氫鈉溶液（0.03mol／L）（68∶32）為流動相，并用磷酸調(diào)p H值為4.4，檢測波長為210nm，柱溫為40℃，流速為1.0m L／min。理論板數(shù)按?；切苋パ跄懰岱逵?jì)算，應(yīng)不低于2500。

2.2 對照品溶液與供試品溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備。取經(jīng)五氧化二磷容器中減壓干燥至恒重的?；切苋パ跄懰釋φ掌愤m量，精密稱定，加甲醇使溶解并定量稀釋制成每1m L含1mg的溶液，即得（相當(dāng)于?；切苋パ跄懰?.9578mg）。

2.2.2 供試品溶液的制備。取引流熊膽粉精制品適量（相當(dāng)于熊膽粉0.12g），精密稱定，置50m L量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率300W，頻率50k Hz）10min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，即得。

2.2.3 測定方法。精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5～10μL，分別注入液相色譜儀，測定，即得。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試樣品溶液，定時（0、3、6、9、12、18、24h）進(jìn)樣測定，保留峰面積積分值分別為：529771、544174、549652、539884、529554、543211，平均值為543707，RSD＝1.51%。測定結(jié)果表明，樣品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，保留峰面積積分值分別為：334463、333690、323125、330456、337473、331841，平均值為331841，RSD＝1.65%。符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.5 線性關(guān)系的考察

精密吸取牛磺熊去氧膽酸對照品溶液（1.0mg／m L）0.5，1.2，5.5，10，20μL，依次注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，以?；切苋パ跄懰釋φ掌愤M(jìn)樣量（μL）為縱坐標(biāo)，繪制保準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y＝498.7X－ 0.0752，r＝0.9974。結(jié)果表明牛磺熊去氧膽酸進(jìn)樣量約在4.2～12.5μL呈良好的線性關(guān)系，最小檢出限（信噪比≥3）為0.56μL。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批次的引流熊膽粉精制品，依照上述處理方法，按前述測定方法重復(fù)測定樣品6次，?；切苋パ跄懰岷繛?1.21%、11.01%、11.07%、10.89%、10.76%、10.94%，平均為10.98mg／m L，RSD＝1.41%，結(jié)果表明此法重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取已知含量的同一批引流熊膽粉精制品20m L，精密加入牛磺熊去氧膽酸對照品溶液適量，按照樣品溶液處理的制備方法操作，測定其含量，并計(jì)算回收率為97.56%、97.01%、98.11%、97.22%、96.98%、98.46%，平均為97.56%，RSD＝0.63%。

2.8 樣品測定結(jié)果

分別精密吸取對照品溶液與樣品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，依上述色譜條件，以外標(biāo)法計(jì)算含量，測定樣品。

2.8.1 常溫下引流熊膽粉精制品含量測定

表1 常溫下引流熊膽粉精制品含量 mg·m L－1

2.8.2 不同溫度條件儲存下的引流熊膽粉精制品，儲存時間30天后，在常溫條件下進(jìn)行含量測定及無菌檢查。

表2 不同溫度下儲存對含量的影響

續(xù)表1

3 討論

3.1 引流熊膽粉精制品儲存過程中溫度對含量的影響。在20℃、0℃、－5℃、－10℃、－15℃、－20℃、－22℃、－24℃、－26℃、－28℃、－30℃等不同儲存溫度條件下，對引流熊膽粉精制品儲存30天后，在常溫條件下進(jìn)行含量測定，確定引流熊膽粉精制品儲存溫度。3.2 引流熊膽粉精制品儲存過程中溫度對無菌的影響。在20℃、0℃、－5℃、－10℃、－15℃、－20℃、－22℃、－24℃、－26℃、－28℃、－30℃等不同儲存溫度條件下，對引流熊膽粉精制品儲存30天后，依據(jù)中華人民共和國藥典10版，附錄ⅩⅢB無菌檢查法進(jìn)行檢查，在常溫條件，進(jìn)行無菌檢測，在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（Thioglycollate Medium）、改良馬丁培養(yǎng)基（Modified Martin Medium）應(yīng)無細(xì)菌和真菌檢出，為適宜的儲存溫度。

3.3 熊膽粉為不規(guī)則的碎片、顆?；蚍勰?，黃色至深棕色，半透明，有玻璃樣光澤，易吸潮結(jié)塊有粘牙感，腥臭，味極苦。精制液位淺黃色液體，精制后不含蛋白質(zhì)及粘液質(zhì)等雜質(zhì)，無腥臭味。對改變制劑的顏色、氣味、澄明度、避免不良反應(yīng)發(fā)生有重要意義。

3.4 經(jīng)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用高效液相色譜法確定引流熊膽粉精制品測定的色譜條件和適用性試驗(yàn)。利用高效液相色譜法測定引流熊膽粉精制品的含量具有專屬性強(qiáng)及結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，確定引流熊膽粉精制品長期存儲的儲存條件，確保應(yīng)用引流熊膽粉精制品的制劑的穩(wěn)定性，為保證制劑質(zhì)量提供依據(jù)。

［1］ 石麗霞.熊膽注射劑的研制與臨床應(yīng)用［J］.中草藥，1998，21（11）：592.

［2］ 徐愚聰.熊膽粉的研究進(jìn)展［J］.華西藥學(xué)雜志，2000（3）.

［3］ 金正男.熊膽注射液的降血脂作用［J］.中草藥，1997（4）.

［4］ 劉玉根.痰熱清注射液的臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2010（9）.