二倍體馬鈴薯花藥培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化

李文霞 寧海龍 張永根 白雅梅 石 瑛 魏峭嶸 張麗莉呂文河*

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；3 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是糧菜兼用型作物，也是僅次于小麥、水稻、玉米的世界第四大糧食作物，具有生育期短、適應(yīng)性強(qiáng)、營養(yǎng)豐富、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、產(chǎn)業(yè)鏈長、開發(fā)利用前景廣闊等特點(diǎn)。二倍體馬鈴薯中有許多非常寶貴的性狀，如高干物質(zhì)含量、低還原糖含量、高蛋白含量，抗霜凍、抗鹽堿、抗寒、抗旱、耐熱等能力較強(qiáng)。因此，以花藥培養(yǎng)為橋梁進(jìn)行二倍體馬鈴薯孤雄生殖有望獲得馬鈴薯新資源。

印度德里大學(xué)的學(xué)者Guha 和Maheshwari（1964）以理解減數(shù)分裂的機(jī)制為目的，培養(yǎng)曼陀羅花藥時(shí)，發(fā)現(xiàn)花藥花粉形成胚，進(jìn)而被誘導(dǎo)形成單倍體植株。我國學(xué)者在花藥培養(yǎng)方面進(jìn)行了廣泛的研究，取得了許多重要的理論與實(shí)踐成果。如在花椰菜（張曉芬 等，2005）、甘藍(lán)（方淑桂 等，2006）、觀賞茄（宋明 等，2005）、羽衣甘藍(lán)（鄒金美 等，2005）、剛果12 號(hào)桉（李守嶺和莊南生，2006）、中國水仙（張清國 等，2010）等植物上通過花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株，但在實(shí)際應(yīng)用中均存在產(chǎn)胚率低等諸多問題。朱明凱等（1985）從馬鈴薯愈傷組織分化出的苗有混倍體（2n=28、32）、雙單倍體（2n=24）和四倍體（2n=48），而從胚狀體誘導(dǎo)成苗的均為雙單倍體（2n=24）。戴朝曦等（1993）首次報(bào)道了用花藥培養(yǎng)法由馬鈴薯一個(gè)典型的雄性不育雙單倍體甘花雙7 號(hào)誘導(dǎo)產(chǎn)生一單倍體，植株之間表現(xiàn)出明顯的性狀分離，經(jīng)鑒定具有典型的一單倍體特征。冉毅東等（1996）用3 種不同溫度的前處理對(duì)馬鈴薯雙單倍體進(jìn)行花藥培養(yǎng)，倍性鑒定結(jié)果表明，從雙單倍體誘導(dǎo)的胚狀體分化的植株絕大多數(shù)為純合二倍體，可能是胚狀體在發(fā)育過程中體細(xì)胞染色體自發(fā)加倍。梁彥濤等（2006）研究馬鈴薯花藥培養(yǎng)影響因素時(shí)發(fā)現(xiàn)馬鈴薯花藥培養(yǎng)對(duì)基因型依賴性很大。

馬鈴薯的花藥培養(yǎng)多以四倍體為研究對(duì)象，獲得的雙單倍體仍為雜合體，限制了很多隱性基因的表達(dá)，為此前人的研究是由馬鈴薯四倍體普通栽培種誘導(dǎo)雙單倍體，再由雙單倍體誘導(dǎo)一單倍體（戴朝曦 等，1993）。本試驗(yàn)以具有優(yōu)良性狀的二倍體馬鈴薯為試驗(yàn)材料，通過一步誘導(dǎo)就可以獲得一單倍體，以達(dá)到即簡化花藥培養(yǎng)程序又能利用二倍體資源優(yōu)良性狀的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為原始二倍體馬鈴薯栽培種S.phureja-S.stenotomum（PHU-STN），經(jīng)選擇適應(yīng)長日照的無性系雜種61 份：BD1-2、BD1-5、BD2-2、BD4-6、BD5-7、BD6-8、BD8-2、BD8-4、BD10-4、BD10-7、BD10-8、BD11-8、BD12-5、BD12-7、BD14-2、BD15-1、BD16-4、BD17-3、BD18-8、BD21-1、BD22-3、BD24-6、BD26-6、BD29-1、BD29-3、BD31-3、BD32-9、BD34-4、BD35-4、BD35-7、BD36-4、BD38-7、BD39-3、BD40-2、BD40-7、BD41-2、BD41-7、BD42-5、BD44-5、BD45-3、BD46-1、BD46-7、BD48-2、BD51-4、BD53-9、BD54-8、BD55-3、BD57-3、BD58-7、BD60-3、BD60-6、BD62-1、BD62-2、BD62-7、BD63-2、BD64-8、BD64-9、BD65-8、BD68-6、BD69-4、BD72-9，均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯研究所保存。

1.2 方法

試驗(yàn)試劑均購自哈爾濱伊事達(dá)生物公司，試驗(yàn)儀器為博訊SW-CJ-2F（D）垂直吹風(fēng)有擋板超凈工作臺(tái)、博訊YXQ-LS-50S11 高壓滅菌器。在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯研究所組培室培養(yǎng)材料，溫度為25 ℃，光暗周期為16 h/8 h。

1.2.1 試驗(yàn)材料種植 61 份材料于2008年4月20日播種于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯網(wǎng)棚、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊試驗(yàn)實(shí)習(xí)基地、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山馬鈴薯研究所試驗(yàn)基地、大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)基地，單行區(qū)，行長2 m，行距0.65 m，株距0.30 m，每行7 株，6月23日開始采集花藥。

2008年篩選出的適合基因型BD10-7、BD40-2、BD54-8、BD46-7、BD29-1、BD12-7，于2009年4月23日播種于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯網(wǎng)棚、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊試驗(yàn)實(shí)習(xí)基地，6月26日開始采集花藥。

1.2.2 適宜基因型的篩選 將花藥接種在基礎(chǔ)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1KT+0.5 mg·L-12,4-D+60 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂（pH 5.8）上（王梓全 等，2007），每處理接種600 個(gè)花藥，30 d 后調(diào)查誘導(dǎo)出愈傷組織的花藥外植體數(shù)目以統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。60 d 后調(diào)查花藥愈傷組織上分化的綠苗數(shù)目以統(tǒng)計(jì)再生植株分化率。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=（產(chǎn)生愈傷組織的花藥數(shù)/接種花藥數(shù)）×100%

再生植株分化率（%）=（再生植株數(shù)/接種花藥數(shù)）×100%

1.2.3 花藥預(yù)處理的篩選 以基因型BD10-7為試驗(yàn)材料，根據(jù)前人研究成果（張曉芬 等，2005；鄒金美 等，2005；王梓全 等，2007；張清國 等，2010），本試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行4 ℃低溫、35 ℃熱激、離心和0.5 mol·L-1甘露醇預(yù)處理的L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）。其中前2項(xiàng)處理設(shè)4 個(gè)水平，分別為0、2、4、6 d；離心處理30 min，轉(zhuǎn)速4 個(gè)水平分別為2 000、4 000、6 000、8 000 r·min-1；甘露醇預(yù)處理為在無菌條件下剝出花藥，浸泡于已滅菌的甘露醇中，分4 個(gè)水平0、1、2、3 d，正交設(shè)計(jì)表見表1。3 次重復(fù)，每處理120 個(gè)花藥，15 d 后調(diào)查出現(xiàn)褐化現(xiàn)象的花藥數(shù)目以統(tǒng)計(jì)花藥褐化率。30 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

褐化率（%）=（褐化花藥數(shù)/接種花藥數(shù)）×100%

1.2.4 激素配比的優(yōu)化 選用基因型BD40-2為試驗(yàn)材料，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同的激素組合，激素配比見表2。15 d 后統(tǒng)計(jì)花藥褐化率，30 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.5 碳源的篩選 選用基因型BD54-8 為試驗(yàn)材料，參照前人研究成果（王梓全 等，2007；周旭紅 等，2011），本試驗(yàn)進(jìn)行碳源處理為：處理1（CK），添加6%蔗糖；處理2，添加3%麥芽糖；處理3，添加6%麥芽糖；處理4，添加9%麥芽糖。15 d 后統(tǒng)計(jì)花藥褐化率，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.6 乙烯拮抗劑的篩選 以基因型BD10-7 為試驗(yàn)材料，參考袁華玲等（2008）研究結(jié)果，乙烯拮抗劑設(shè)3 個(gè)處理：處理1（CK），不添加乙烯拮抗劑；處理2，添加50 mg·L-1AgNO3；處理3，添加1 mmol·L-1硫代硫酸銀（STS）。每瓶接種花藥40 個(gè)，每處理接種6 瓶，3 次重復(fù)。15 d 后統(tǒng)計(jì)花藥褐化率，30 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

表1 低溫、熱激、離心轉(zhuǎn)速、甘露醇預(yù)處理的L16（45）正交設(shè)計(jì)

表2 激素配比的優(yōu)化

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)1.2.2、1.2.4、1.2.5、1.2.6 統(tǒng)計(jì)3 次重復(fù)的平均數(shù)，對(duì)1.2.3 進(jìn)行數(shù)據(jù)的反正弦轉(zhuǎn)換，之后進(jìn)行方差分析（寧海龍，2012）。全部試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 9.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)和植株再生的影響

61 份材料中共有13 個(gè)基因型能夠誘導(dǎo)出愈傷組織（圖1-A），愈傷組織誘導(dǎo)率見表3。從表3 可以看出，這13 個(gè)基因型中BD60-3、BD46-1、BD54-8 愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)到3.33%，其次為BD40-2、BD10-7 和BD64-8，分別為2.17%、1.67%和1.33%。在這13 個(gè)基因型中，有6個(gè)能夠分化出再生植株（圖1-B），其中再生植株分化率最高的是BD40-2，達(dá)到10.00%，其次為BD54-8 和BD12-7，分別為3.33%和1.67%。綜合上述分析，基因型BD40-2、BD54-8 和BD10-7 為二倍體花藥培養(yǎng)最適基因型。

圖1 馬鈴薯花藥誘導(dǎo)的組織愈傷和再生植株

2.2 預(yù)處理對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷褐化和愈傷誘導(dǎo)的影響

預(yù)處理各因素對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)褐化和誘導(dǎo)的影響見表4。各因素對(duì)花藥培養(yǎng)褐化率和誘導(dǎo)率的F值均達(dá)到極顯著水平，說明各因素對(duì)降低二倍體馬鈴薯花藥培養(yǎng)的褐化率和提高誘導(dǎo)率有極顯著效應(yīng)。各因素對(duì)褐化率的影響為熱激＞離心＞甘露醇＞低溫，而各因素對(duì)誘導(dǎo)率的影響為低溫＞熱激＞甘露醇＞離心。

預(yù)處理各因素各水平對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)褐化率的影響見表5。低溫預(yù)處理6 d 的褐化率顯著低于低溫預(yù)處理0、2、4 d，但低溫預(yù)處理0、2、4 d 3 個(gè)處理之間差異不顯著；熱激預(yù)處理4 d 的褐化率極顯著低于其他處理，熱激預(yù)處理0、2 d 之間差異不顯著，但顯著低于熱激預(yù)處理6 d；離心預(yù)處理4 000 r·min-1的褐化率極顯著低于離心預(yù)處理2 000、6 000、8 000 r·min-1，但離心預(yù)處理2 000、6 000、8 000 r·min 3 個(gè)處理之間差異不顯著；甘露醇預(yù)處理2 d 的褐化率極顯著低于甘露醇預(yù)處理3 d，但與甘露醇預(yù)處理0、1 d 之間差異不顯著。

預(yù)處理各因素各水平對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)率的影響見表6。低溫預(yù)處理6 d 的誘導(dǎo)率極顯著高于低溫預(yù)處理0、2、4 d，但低溫預(yù)處理0、2、4 d 3 個(gè)處理之間差異不顯著；熱激預(yù)處理4d 的誘導(dǎo)率極顯著高于其他熱激預(yù)處理，熱激預(yù)處理2 d 的誘導(dǎo)率顯著高于熱激預(yù)處理6 d，但熱激預(yù)處理0、2 d 之間差異不顯著；離心預(yù)處理4 000 r·min-1的誘導(dǎo)率極顯著高于其他離心預(yù)處理；甘露醇預(yù)處理2 d 的誘導(dǎo)率極顯著高于甘露醇預(yù)處理0、1、3 d，甘露醇預(yù)處理1 d 的誘導(dǎo)率顯著高于甘露醇預(yù)處理3 d。

表3 不同基因型對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)和植株再生的影響

表4 不同預(yù)處理對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)褐化率、誘導(dǎo)率影響的方差分析

表5 預(yù)處理各因素對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)褐化率的影響

表6 預(yù)處理各因素對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)率的影響

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)褐化程度沒有達(dá)到死亡狀態(tài)的花藥仍能誘導(dǎo)出愈傷（圖2），因此通過上述分析，確定最佳的預(yù)處理組合為低溫6 d、熱激4 d、離心4 000 r·min-1、甘露醇2 d。

2.3 激素配比對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷褐化和愈傷誘導(dǎo)的影響

由表7 可以看出，2,4-D 為1.0 mg·L-1、6-BA 為0.2 mg·L-1的激素配比（處理6）的馬鈴薯花藥褐化率最低，為85.13%，但該配比的誘導(dǎo)率為1.90%，僅高于處理2 和處理3。2,4-D 為1.0 mg·L-1、6-BA 為0.1 mg·L-1的激素配比（處理5）的馬鈴薯花藥褐化率在各處理中較低，僅高于處理6，但該配比的誘導(dǎo)率為10.56%，在所有處理中最高。

圖2 馬鈴薯褐化花藥誘導(dǎo)的愈傷

2.4 碳源對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷褐化和愈傷誘導(dǎo)的影響

碳源及濃度水平的篩選結(jié)果見表 8。麥芽糖濃度為 3%時(shí)，馬鈴薯花藥褐化率最低，為93.23%，而誘導(dǎo)率較高，達(dá)到2.60%，高于對(duì)照；麥芽糖濃度為9%時(shí)，馬鈴薯花藥褐化率低于對(duì)照，為97.91%，而誘導(dǎo)率最高，達(dá)到2.69%。由于麥芽糖濃度為3%和9%兩個(gè)水平對(duì)花藥培養(yǎng)的影響差異不大，為節(jié)約成本，本試驗(yàn)選用麥芽糖濃度為3%的水平。

2.5 乙烯拮抗劑對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷褐化和愈傷誘導(dǎo)的影響

不同處理對(duì)二倍體馬鈴薯花藥培養(yǎng)褐化和誘導(dǎo)的影響方差分析表明（表9），培養(yǎng)基中不添加乙烯拮抗劑、添加50 mg·L-1AgNO3和添加1 mmol·L-1STS 對(duì)褐化和誘導(dǎo)影響的F值分別為12.01 和44.07，均達(dá)到顯著水平，說明培養(yǎng)基中添加乙烯拮抗劑對(duì)降低二倍體馬鈴薯花藥培養(yǎng)的愈傷褐化率和提高愈傷誘導(dǎo)率均有顯著效應(yīng)。

乙烯拮抗劑處理對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)褐化的影響見表 10。培養(yǎng)基中添加 50 mg·L-1AgNO3處理和添加1 mmol·L-1STS 處理的褐化花藥數(shù)均與對(duì)照差異達(dá)到顯著水平，但這2 個(gè)處理之間差異不顯著。3 個(gè)處理誘導(dǎo)愈傷組織數(shù)之間差異顯著。培養(yǎng)基中添加1 mmol·L-1STS 誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)顯著高于培養(yǎng)基中添加50 mg·L-1AgNO3。

表7 不同激素配比對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷褐化和愈傷誘導(dǎo)的影響

表8 不同碳源對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷褐化和愈傷誘導(dǎo)的影響

表9 乙烯拮抗劑對(duì)馬鈴薯花藥褐化和愈傷誘導(dǎo)影響的方差分析

3 結(jié)論與討論

表10 不同乙烯拮抗劑對(duì)馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷褐化和愈傷誘導(dǎo)的影響

本試驗(yàn)以篩選的適宜基因型進(jìn)行后續(xù)不同處理的各項(xiàng)研究，因材料資源的限制，不同的試驗(yàn)處理選用的基因型材料不一致。但每項(xiàng)處理所用的材料均為適宜花藥培養(yǎng)的基因型，因此得出的試驗(yàn)結(jié)論能夠代表該項(xiàng)處理的試驗(yàn)結(jié)果?；蛐褪怯绊戱R鈴薯花藥培養(yǎng)效率的一個(gè)主要因子，研究表明（盧翠華 等，2005；梁彥濤 等，2006），花粉植株的誘導(dǎo)率與供試材料的基因型有很大關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致，從61 份基因型中篩選出6 份適合花藥培養(yǎng)的基因型。

培養(yǎng)前對(duì)花藥進(jìn)行預(yù)處理，實(shí)質(zhì)上是對(duì)其進(jìn)行某種形式的脅迫，通過外界逆境因素的刺激，促使花藥內(nèi)離體小孢子完成從活體內(nèi)配子體發(fā)育轉(zhuǎn)為離體下的孢子體發(fā)育，即脫分化啟動(dòng)（Pechan & Keller，1988）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)褐化率的影響為熱激＞離心＞甘露醇＞低溫，而各因素對(duì)誘導(dǎo)率的影響為低溫＞熱激＞甘露醇＞離心，這導(dǎo)致如果單純以褐化率或誘導(dǎo)率為指標(biāo)的矛盾現(xiàn)象，因此根據(jù)試驗(yàn)中的具體情況，褐化程度沒有達(dá)到死亡狀態(tài)的花藥仍能誘導(dǎo)出愈傷，綜合考慮褐化率和誘導(dǎo)率兩項(xiàng)指標(biāo)確定最佳的預(yù)處理為低溫6 d、熱激4 d、離心4 000 r·min-1、甘露醇處理2 d。

培養(yǎng)基中激素的種類、用量和配比對(duì)誘發(fā)小孢子啟動(dòng)、分裂、生長和分化具有作用（周旭紅 等，2011）。2,4-D 對(duì)許多作物花粉的啟動(dòng)、分裂、形成愈傷組織和胚狀體起著決定性的作用（陳曉 等，2003）。單一激素成分培養(yǎng)的效果較差，合理的激素配比是保證組培效果的基礎(chǔ)（周旭紅 等，2011）。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)1.0 mg·L-12,4-D、0.1 mg·L-16-BA 的激素配比的花藥愈傷誘導(dǎo)率最高。戴朝曦（1991）認(rèn)為6%的蔗糖濃度有利于多數(shù)馬鈴薯材料的胚狀體發(fā)生，這可能與花粉細(xì)胞或體細(xì)胞的滲透壓有關(guān)，但濃度過高也不利于愈傷組織的誘導(dǎo)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)麥芽糖濃度為3%較適合愈傷的誘導(dǎo)。

褐化是花藥死亡的主要因素（冉毅東和戴朝曦，1993），本試驗(yàn)首次將STS 引入到馬鈴薯的花藥培養(yǎng)中。研究發(fā)現(xiàn)盡管培養(yǎng)基中添加AgNO3和STS 對(duì)降低花藥的褐化率差異不顯著，但對(duì)提高花藥培養(yǎng)的愈傷誘導(dǎo)率差異顯著。筆者認(rèn)為同預(yù)處理的效應(yīng)一樣，輕度褐化的花藥也能誘導(dǎo)愈傷。應(yīng)振土和陳昆松（1990）認(rèn)為，低濃度的STS 對(duì)植物組織沒有毒害作用，但它卻有效地抑制了乙烯的生物學(xué)作用。而AgNO3在抑制乙烯生物學(xué)作用的同時(shí)，對(duì)原生質(zhì)的本身有毒害作用。因此本試驗(yàn)認(rèn)為STS 對(duì)花藥的毒害作用要小于AgNO3，這與前人的研究結(jié)果一致。

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