植物提取物對瓜類枯萎病菌的抑菌活性

范海延*

（1 沈陽農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，遼寧沈陽 110866；2 武警遼寧總隊后勤部農(nóng)副業(yè)生產(chǎn)基地，遼寧沈陽 110866）

瓜類枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporium）寄生引起的一種土傳病害，全國各菜區(qū)都有分布，危害多種瓜類作物，其中以黃瓜、西瓜、甜瓜等受害較重，病田一般減產(chǎn)20%～30%，嚴重田塊可達50%～60%，甚至絕產(chǎn)。一直以來，化學防治是控制土傳病害的主要手段，但隨著化學農(nóng)藥的大量使用，產(chǎn)生了環(huán)境污染、農(nóng)藥抗性及農(nóng)藥殘留等令人擔憂的問題。因此，使用對生態(tài)環(huán)境無害的生防殺菌劑替代化學農(nóng)藥已經(jīng)成為一種趨勢。

植物是生物活性化合物的巨大天然寶庫，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過400 000 種，國內(nèi)外研究已發(fā)現(xiàn)許多植物提取物中含有抑菌活性成分，在植物源殺菌劑開發(fā)和應用方面也取得了一定的成果（孟昭禮 等，1995，2002；于平儒 等，2001；李瑞 等，2006；喬康和姬小雪，2009；趙成愛 等，2010）。但從總體來看，國內(nèi)外針對作物病害的植物源殺菌劑的應用開發(fā)研究還是比較落后，真正投入到市場上的植物源殺菌劑品種不多，還有待于加大植物源抗菌活性物質(zhì)的基礎(chǔ)研究，以開發(fā)出更多具有市場競爭力的植物源殺菌劑品種。本試驗利用超聲波輔助提取法從27 種植物中提取活性物質(zhì)，采用生長速率法進行離體抑菌試驗確定其對3 種瓜類枯萎病菌的抑菌活性，并對狼毒大戟、藿香、肉桂、黃檗等植物提取物進行預防性、治療性和誘導抗病性的室內(nèi)盆栽效果評價，旨為今后深入研究提供參考。

表1 供試植物

1 材料與方法

1.1 供試植物

老鸛草、茴茴蒜、白頭翁、毛茛和白屈菜采于沈陽市東陵天柱山，狼毒大戟采自吉林省遼源市，其余藥用植物購自沈陽同仁堂，詳見表1。

1.2 供試菌種

供試菌種為黃瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporiumf.sp.cucumberinumOwen）、西瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum），由沈陽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部北方農(nóng)作物病害免疫實驗室提供；甜瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporumf.sp.melonis）由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所植保室園藝作物病害診斷與控制研究組提供。

1.3 試驗方法

試驗于2008年11月～2009年11月在沈陽農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院創(chuàng)新實驗室進行。

1.3.1 植物提取物的制備 取粉碎的干燥植物材料5 g，按料液比1︰20 加入到80%乙醇溶液中，于60 ℃、700 W 功率下進行超聲提取兩次，每次超聲時間為30 min，合并濾液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，再將濃縮液置于冷凍干燥機中干燥12 h，制成提取物干粉。

用5%乙醇溶液溶解干粉，配制成1.0 g·mL-1的植物粗提物母液，0～4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 植物粗提物對病原菌菌絲生長的抑制作用 在無菌條件下，取上述植物提取物1.0 mL，加入9.0 mL 熱培養(yǎng)基，搖勻，對照組中加入等量的無菌水，倒入融化的PDA 培養(yǎng)基至10.0 mL，搖勻、制成平板。接種生長一致的供試菌菌餅（φ＝6.0 mm），使菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，25 ℃下培養(yǎng)，于接種后第4 天用十字交叉法測定供試菌菌落的生長直徑。抑菌試驗共2個處理（培養(yǎng)基加植物提取液和培養(yǎng)基加0.5%乙醇的對照），每處理3 次重復。

菌落生長直徑=菌落直徑平均值-6.0 mm

菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/對照菌落生長直徑×100%

1.3.3 活體盆栽試驗 在PDA 培養(yǎng)基中活化黃瓜枯萎病菌，25 ℃下培養(yǎng)3 d，再轉(zhuǎn)入PDA 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4～5 d，菌液過濾，除去菌絲，將濾液經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min，取沉淀加蒸餾水稀釋成孢子濃度為5×105個·mL-1的懸浮液，備用。將黃瓜種子放入無菌水中催發(fā)24 h，選取健康的萌發(fā)種子栽種于新育苗缽內(nèi)，基質(zhì)為草炭和蛭石，溫室中正常管理，待黃瓜長至兩葉一心時進行試驗處理。

預防效果測定：在黃瓜幼苗植株根部分別灌入一定濃度的植物提取物5 mL，對照灌入5 mL 無菌水，2 h 后每株幼苗定量灌注5 mL 黃瓜枯萎病菌懸浮液，并于夜間進行保濕培養(yǎng)。每處理30 株，3 次重復，待空白對照充分發(fā)病后進行病情分級調(diào)查，并計算病情指數(shù)和防治效果。

治療效果測定：在每株黃瓜幼苗植株根部定量灌注5 mL 黃瓜枯萎病菌懸浮液，發(fā)病后再于黃瓜幼苗植株根部分別灌入一定濃度的植物提取物5 mL，以清水處理為對照。每處理30 株，3次重復，7 d 后進行病情調(diào)查。

誘導抗病效果測定：在黃瓜幼苗葉面均勻噴施一定濃度的植物提取物，對照噴施清水，24 h后每株幼苗定量灌注5 mL 黃瓜枯萎病菌懸浮液。每處理30 株，3 次重復，待空白對照充分發(fā)病后進行病情調(diào)查。

黃瓜枯萎病分級標準（馬麗娟 等，2008）如下。

0 級，全株無??；1 級，發(fā)病輕微，全株有1/4 以下的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；2 級，發(fā)病較重，全株有1/4～1/2 的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；3 級，發(fā)病重，全株有1/2 以上的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；4 級，因病枯死或接近死亡。

病情指數(shù)=Σ（各級發(fā)病數(shù)×代表級數(shù)）/（總調(diào)查株數(shù)×4）×100

防治效果（%）=（對照平均病情指數(shù)-處理平均病情指數(shù)）/對照平均病情指數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 植物提取物對3 種枯萎病菌菌絲生長的抑制作用

27 種植物提取物對3 種枯萎病菌菌絲生長抑制作用見表2，當提取物濃度為0.1 g·mL-1時，供試植物樣品對3 種枯萎病菌的菌絲生長均有一定的抑制作用。其中，白屈菜、藿香、肉桂、黃檗、龍葵、狼毒大戟提取物對3 種供試枯萎病菌的抑制率均可達70%以上；威靈仙、蒼耳、旋覆花、防風提取物對黃瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌的抑制效果較好，抑制率達50%以上，但對西瓜枯萎病菌的抑制效果較差（除威靈仙外）；毛茛提取物對黃瓜枯萎病菌的抑制率為50.40%，白頭翁和萹蓄提取物對西瓜枯萎病菌的抑制率分別為55.70%、50.00%。其他植物提取物抑菌活性較差，抑制率均在50%以下。

2.2 室內(nèi)盆栽預防效果評價

狼毒大戟、藿香、肉桂和黃檗等4 種植物的提取物對室內(nèi)盆栽黃瓜幼苗枯萎病菌的預防效果見表3。

由表3 可以看出，供試的4 種植物提取物對黃瓜枯萎病菌均有一定的預防效果。其中，狼毒大戟和黃檗提取物對黃瓜幼苗枯萎病菌的預防效果最好，0.20 g·mL-1的黃檗提取物和0.015 g·mL-1的狼毒大戟提取物的防治效果分別高達83.33%和70.54%；肉桂提取物的預防效果也較好，當提取物濃度為0.25 g·mL-1時，防治效果達58.14%；而0.20 g·mL-1藿香提取物的預防效果較差。

另外，試驗中還發(fā)現(xiàn)當提取物施用濃度過高時會出現(xiàn)燒苗現(xiàn)象。

2.3 室內(nèi)盆栽治療效果評價

狼毒大戟、藿香、肉桂和黃檗等4 種植物提取物對室內(nèi)盆栽黃瓜幼苗枯萎病菌的治療效果見表4。

由表4 可以看出，供試的4 種植物提取物對黃瓜枯萎病菌均有一定的治療效果。其中，狼毒大戟和肉桂提取物對黃瓜幼苗枯萎病菌的治療效果較好，0.015 g·mL-1的狼毒大戟提取物和0.25 g·mL-1的肉桂提取物的防治效果分別達57.89%和51.62%；而0.20 g·mL-1黃檗提取物和藿香提取物對黃瓜幼苗枯萎病菌的治療效果不明顯，防治效果分別為27.78%和21.04%。

2.4 室內(nèi)盆栽誘導抗病效果評價

藿香、肉桂、黃檗提取物對黃瓜幼苗的誘導抗病作用效果見表5?？紤]到狼毒大戟毒性較大，不宜直接葉面噴施，故未進行誘導抗病試驗。

由表5 可以看出，一定濃度的藿香、肉桂、黃檗提取物均具有較好的誘導抗病作用。其中，0.40 g·mL-1藿香提取物的誘導抗病防治效果最好，高達75.60%；0.25 g·mL-1肉桂提取物和0.20 g·mL-1黃檗提取物的誘導抗病防治效果可達50%以上。

表2 植物提取物對3 種瓜類枯萎病菌菌絲生長的抑制作用

表3 植物提取物對黃瓜枯萎病菌的預防效果

表4 植物提取物對黃瓜枯萎病菌的治療效果

3 結(jié)論與討論

表5 植物提取物對黃瓜幼苗的誘導抗病效果

植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)在長期的進化過程中已經(jīng)形成了固定的參與能量和物質(zhì)循環(huán)的代謝途徑，在實際使用當中，不易產(chǎn)生殘留及生物富集現(xiàn)象。目前國內(nèi)外的研究都普遍認為，植物源農(nóng)藥對非靶標生物相對安全，比如印楝素對家兔、野鴨、七星瓢蟲、蜜蜂、鳥類等都僅具有很低的毒性（趙善歡，2000；吳鉅文和陳建峰，2002），因此開發(fā)利用植物源農(nóng)藥用于生物防治的前景十分廣闊。

本試驗結(jié)果表明，供試27 種植物乙醇提取物對3 種瓜類枯萎病菌均有不同程度的抑制作用，其中狼毒大戟、白屈菜、藿香、肉桂、黃檗、龍葵等對3 種供試枯萎病菌的菌絲生長具有明顯的抑制效果，抑制率均在70%以上，值得作為植物源殺菌劑進一步研究。同時，本試驗對狼毒大戟、藿香、肉桂、黃檗4 種植物的提取物進行了預防性、治療性和誘導抗病性的活體盆栽試驗。結(jié)果表明，0.015 g·mL-1的狼毒大戟提取物對黃瓜幼苗抗枯萎病菌的預防效果和治療效果均較好，分別可達70.54%和57.89%；0.25 g·mL-1的肉桂提取物對黃瓜幼苗抗枯萎病菌的預防作用、誘導抗病作用、治療作用的效果均可達50%以上；而對于藿香提取物來說，誘導抗病效果最佳，而預防作用和治療作用效果不明顯；0.20 g·mL-1黃檗提取物的預防效果高達83.33%，誘導抗病防治效果也可達55.55%，但治療作用效果不明顯。另外，試驗中也發(fā)現(xiàn)當植物提取物施用濃度過高時會出現(xiàn)燒苗現(xiàn)象。

由于植物源抑菌活性成分為植物的一類或幾類次生代謝物質(zhì)，活性物質(zhì)化學成分復雜、絕大多數(shù)沒有明確；活性物質(zhì)的種類、含量受自身遺傳因子、外界環(huán)境條件的影響，會有地域性和季節(jié)性變化，并且活性成分在植物不同部位含量亦不同，使活性成分的含量和活性強度不穩(wěn)定（邵云東 等，2003；石志紅 等，2004）。因此，今后應重點針對目標病害進行植物源高抗菌活性化合物的深入篩選，發(fā)掘具有殺菌或抑菌活性的植物資源；根據(jù)生物防治原理，從植物中分離天然抑菌活性物質(zhì)，應用活性跟蹤法確定高效提取抑菌活性物質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)與工藝路線；并在活性追蹤指導下對重要植物的抑菌活性成分進行分離、結(jié)構(gòu)闡明以及構(gòu)效關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)生理活性先導化合物或活性成分，為新型植物源殺菌劑開發(fā)提供先導化合物。

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