薄層色譜和熒光分析法測定黃連生物堿在高速逆流色譜溶劑體系中分配系數(shù)的方法

紀(jì) 佳

鄭州人民醫(yī)院藥劑科，河南鄭州 450000

黃連是一種我國常用的中藥，味苦，性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒的治療功效，臨床上用來治療心煩、腹痛、嘔吐、脈促、下利等。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)黃連中主要含有的生物堿有小檗堿、黃連堿、巴馬汀等原小檗堿型的生物堿。本研究觀察薄層色譜和熒光分析法測定黃連生物堿在高速逆流色譜溶劑體系中分配系數(shù)的方法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

國產(chǎn)高速逆流色譜儀（T300B），日本產(chǎn)熒光分光光度計（F4500），國產(chǎn)紫外儀，國產(chǎn)超聲波清洗器（KQ250B），國產(chǎn)旋渦混合器（XW80A），國產(chǎn)微量高速離心機（TG16W），國產(chǎn)薄層色譜硅膠板。

1.2 試藥

黃連堿標(biāo)準(zhǔn)品，小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)品，表小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（以上藥品均購自中藥藥品生物制品檢定所），色譜純乙腈，分析純其他試劑。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別精密稱取黃連堿、小檗堿、巴馬汀、表小檗堿的對照品2 mg，分別于4 mL無水乙醇中100 KHz超聲溶解5 min，即得對標(biāo)準(zhǔn)品溶液，放置在0℃環(huán)境中進行保存?zhèn)溆肹1]。

2.2 樣品溶液的制備

稱取黃連70%的乙醇提取物浸膏4 g（已知含有黃連堿9.21%，巴馬汀3.98%，表小檗堿3.45%，小檗堿18.50%）于4 mL無水乙醇中100 KHz超聲溶解5 min，即得樣品溶液，放置在0℃環(huán)境中進行保存?zhèn)溆肹2]。

2.3 供試品溶液的制備

稱取適量的黃連總生物堿粗提物，將其溶解于氯仿（4）︰甲醇（1.5）︰0.2 mol/L鹽酸（2）溶液體系中，進行完全溶解后靜置等待分層，收集等量的上下相，即得對供試品溶液，放置在0℃環(huán)境中進行保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 薄層色譜條件

使用10 cm×10 cm，厚度為3 mm的薄層板；使用的展開劑為環(huán)己烷（3）︰乙酸乙酯（3.5）︰異丙醇（1）︰甲醇（1.5）︰水（0.5）︰三乙胺（1）。首先將適量的黃連生物堿樣品用毛細管在硅膠薄層板上進行點板，然后將點好樣品的薄層板放置在已使用氨水預(yù)飽和20 min的展開缸里，進行展開，展開后取出晾干，放置在365 nm紫外燈下進行檢測[3]。

2.5 熒光分析方法

將點有樣品溶液的薄層色譜板展開后放置在365 nm紫外燈下進行檢測，在對應(yīng)的熒光斑點的位置畫出標(biāo)記，進行定量的樣品刮取，將樣品放置在1.5 mL的離心管中后，加入1 mL的無水乙醇進行渦旋搖勻后使用超聲儀20 min進行提取，在使用設(shè)定在4 000轉(zhuǎn)/min的離心儀進行5 min離心操作后，移取上清液放置在1.5 mL的離心管中，再吸取樣品適量加入無水乙醇2 mL，搖勻后進行樣品的熒光強度分析，設(shè)定熒光光譜的波長為409 nm，激發(fā)光波長為365 nm，入射狹縫帶寬為5 nm，出射狹縫帶寬為5 nm，設(shè)定環(huán)境溫度為25℃。

2.6 線性關(guān)系考察

精密分別吸取濃度為0.5g/L的含4種黃連堿的標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1、2、3、4、5、6 μL，進行點板、展開、刮板、提取，按“熒光分析方法”下進行各樣品熒光強度的檢測，以樣品濃度和熒光強度進行線性回歸，計算4種生物堿的實驗檢測的線性范圍以及回歸方程。

2.7 加樣回收實驗

精密稱取4種已知含量的生物堿樣品溶液，在1.0、1.5、2.0 g/L 3個水平加入混合對照品溶液在每個水平進行6次平行檢測，計算回收率。

2.8 薄層色譜和熒光分析法測定分配系數(shù)計算

使用毛細管對黃連生物堿的上下相溶液進行等量吸取，并均點于同一個硅膠薄層板之上，在“薄層色譜條件”下進行展開后，使用“熒光分析方法”下進行刮板和提取，測定上下相中的4種黃連生物堿各自的熒光強度，并且在第3、5、8、10日進行重復(fù)性的測量，將測定值進行相比計算出樣品各自的分配系數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 實驗準(zhǔn)確度

得到黃連素的回歸方程是I=442.79+139.86c（r=0.999 9），線性范圍為0.5~2.5 g/L；表小檗堿的回歸方程是I=489.89+153.80c（r=0.999 8），線性范圍為0.5~2.5 g/L；小檗堿的回歸方程是I=395.5+167.45c（r=0.999 9），線性范圍為 0.5~2.5 g/L；巴馬汀的回歸方程是I=356.9+173.89c（r=0.999 9），線性范圍為1.0~3.0 g/L。在線性范圍內(nèi)4種生物堿均具有良好的線性關(guān)系。見表1。

表1 4種生物堿的線性回歸方程以及回歸系數(shù)

3.2 實驗回收率

得出黃連堿的平均加樣回收率為98.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.93%；表小檗堿的平均加樣回收率為103.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.61%；小檗堿的平均加樣回收率為95.3%相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.36%；巴馬汀的平均加樣回收率為97.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.72%。

3.3 薄層色譜和熒光分析法測定分配系數(shù)

黃連堿的Rf值是0.74，分配系數(shù)是2.20；表小檗堿的Rf值是0.61，分配系數(shù)是1.60；小檗堿的Rf值是0.29，分配系數(shù)是0.83；巴馬汀的Rf值是0.21，分配系數(shù)是0.83。

4 討論

本研究當(dāng)黃連生物堿的樣品在溶劑體系分配平衡之后，收集等量的上下相，使用薄層色譜法進行點板，展開等操作后使用熒光分光光度分析法對黃連生物堿的樣品熒光值進行檢測，計算黃連生物堿在高速逆流色譜溶劑體系中的分配系數(shù)。確定在線性范圍內(nèi)4種生物堿均具有良好的線性關(guān)系；黃連堿的Rf值是0.74，分配系數(shù)是2.20；表小檗堿的Rf值是0.61，分配系數(shù)是1.60；小檗堿的Rf值是0.29，分配系數(shù)是0.83；巴馬汀的Rf值是0.21，分配系數(shù)是0.83。不但有效的避免了中藥復(fù)雜成分中的相互之間的干擾[4]，同時也顯著性的提高進行中藥化學(xué)分析的真確度和靈敏度。綜上所述，使用薄層色譜和熒光分析法對黃連生物堿在高速逆流色譜溶劑體系中分配系數(shù)進行測定具有檢測時間短、準(zhǔn)確度高、應(yīng)用范圍比較廣的諸多優(yōu)點，值得推廣使用。

[1] 賀凱，李學(xué)剛，陳紅英，等.薄層色譜—熒光法測定黃連素生物堿分配系數(shù)[J].分析化學(xué)，2011，39（4）：572-575.

[2] 蘇本正.黃連配方顆粒薄層鑒別方法研究[J].山西中醫(yī)，2011，27（11）：49-50.

[3] 王道武，龐雪，趙全成，等.黃連生物堿的反相高效液相—電噴霧離子阱串聯(lián)質(zhì)譜的研究[J].分子科學(xué)學(xué)報，2011，27（3）：189-193.

[4] 于俊林，楊文娣，王朝暉.鮮黃連生物堿成分研究[J].中藥材，2003，26（10）：727-728.