一株具抗菌活性的恒山黃芪內(nèi)生真菌的分離與鑒定

周 鳳， 劉 瑞， 張弘弛， 張 睿

(山西大同大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009)

0 引言

內(nèi)生真菌(endophytic fungi)泛指某些特殊的真菌，它生活史的一定階段或全部階段寄生于健康植物的組織和器官內(nèi)部，而被感染的宿主植物不表現(xiàn)出外在病癥[1]，可通過組織學(xué)方法從經(jīng)過嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離.由于內(nèi)生真菌與宿主植物具有長期的互惠共存共生關(guān)系，所以這些真菌代謝產(chǎn)物類型多樣，目前內(nèi)生真菌被認(rèn)為是篩選新型抗生素的重要資源[2-4].

中國藥典規(guī)定藥用黃芪(Astragalusmembranaceu)為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根[5].恒山黃芪屬于蒙古黃芪，又稱為正北芪，是我國特有的地道黃芪，其品質(zhì)和產(chǎn)量位居全國首位.目前藥理研究表明，黃芪在心血管、免疫、抗癌、抗衰老以及在血液、肝臟、腎臟等方面有重要的藥理作用[6].為了從植物內(nèi)生真菌中尋找具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，目前已從恒山黃芪中分離得到49株內(nèi)生真菌并進(jìn)行了初步篩選[7]，本文將對(duì)1株來自恒山黃芪根部的高活性內(nèi)生真菌進(jìn)行進(jìn)一步研究，為全面開發(fā)與利用黃芪內(nèi)生真菌資源提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料及來源

恒山黃芪全株植物(根、莖、葉)于2010年8月采自山西省北岳恒山陽坡，大約3年生植株，植物樣品生長健康無外在病癥.

1.1.2培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基為PDA固體培養(yǎng)基；細(xì)菌指示菌培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；植物病原菌指示菌用PDA固體培養(yǎng)基.滅菌條件為121 ℃、30 min.

1.1.3指示菌株及來源

革蘭氏陽性菌：金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis(Ehrenberg)Cohn)；革蘭氏陰性菌：大腸桿菌(Escherichiacoli)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa).植物病原菌選用番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、煙草赤星病菌(Alternariaalternata)、蘋果腐爛病菌(Valsamali)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum).以上菌種由西北農(nóng)林科技大學(xué)資環(huán)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 方法

1.2.1內(nèi)生真菌的分離純化

取健康黃芪葉，先用無菌水沖洗干凈，晾干水分后，用已滅菌的剪刀將葉片剪成0.5cm×0.5cm小塊.按下述步驟進(jìn)行表面消毒：75%乙醇消毒30s，3%次氯酸鈉消毒2min，再用75%乙醇消毒1min，無菌水沖洗2～3次.恒山黃芪根和莖，切成1cm×1 cm的小塊，做相同的處理.以上材料分別置于已倒好的PDA培養(yǎng)基上，放置在28 ℃培養(yǎng)3～7d后，觀察皿中材料切口處長出菌絲(菌落)，采用頂端菌絲挑取法，選擇不同形態(tài)的菌落，轉(zhuǎn)入到新配制的PDA培養(yǎng)基中，連續(xù)接代幾次，即得內(nèi)生真菌，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)并對(duì)菌株進(jìn)行編號(hào)，低溫保存.分離過程采用組織印跡法[8] 和漂洗液檢驗(yàn)法[9]進(jìn)行滅菌效果的檢驗(yàn).

1.2.2抗菌活性內(nèi)生真菌的篩選方法

(1)含指示菌培養(yǎng)基的制作

用5mL無菌生理鹽水直接沖洗培養(yǎng)好的指示菌斜面，搖勻后，采用血球計(jì)數(shù)法，將菌懸液的濃度分別稀釋到105CFU/mL(細(xì)菌)和104CFU/mL(真菌).取1mL稀釋后的菌懸液快速加入40～50 ℃融化的9mL培養(yǎng)基中，搖勻后迅速倒入培養(yǎng)皿(?90)中，冷卻后得到含有各指示菌的培養(yǎng)基.

(2)內(nèi)生真菌篩選(菌餅法[10])

將分離的純菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后取出，然后用6mm孔徑的打孔器在內(nèi)生菌菌落邊緣切取圓柱形瓊脂塊(帶菌苔)，再用接種針挑取菌餅移植于含指示菌的培養(yǎng)基上，每個(gè)指示菌的培養(yǎng)皿中放2～3個(gè)內(nèi)生真菌菌餅.將制好的培養(yǎng)皿置于28 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2～4d(真菌)，36 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)1～3d(細(xì)菌)，觀察結(jié)果，采用十字交叉法測(cè)其抑菌圈的大小.為保證體外活性篩選試驗(yàn)的可重復(fù)性，每株內(nèi)生真菌對(duì)每種指示菌做3個(gè)重復(fù)試驗(yàn).

1.2.3抗菌活性內(nèi)生真菌的鑒定

(1)內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)有高活性的黃芪內(nèi)生真菌進(jìn)行分類鑒定，分類檢索參照文獻(xiàn)[11].

菌落形態(tài)觀察：采用點(diǎn)植法把菌種接到PDA平板培養(yǎng)基，觀察真菌菌絲的生長和培養(yǎng)基色澤變化情況，連續(xù)觀察7d.

菌絲和孢子形態(tài)觀察：采用制片觀察法，先在載玻片上滴加乳酸石炭酸棉藍(lán)染液，用解剖針從菌落邊緣處挑取少量產(chǎn)孢子的菌絲，在載玻片上用解剖針分散開菌絲，經(jīng)染液染色后置于顯微鏡下觀察.

(2)真菌的分子生物學(xué)鑒定

真菌DNA提取：將具有抗菌活性的真菌在CM液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng), 按下述步驟處理：菌體用8層無菌紗布過濾，用無菌水沖洗2次，再分別用PBS溶液和無菌生理鹽水各沖洗2次，無菌紗布盡量擠干水分；將菌體加入滅菌研缽中，在倒入液氮同時(shí)迅速研磨菌絲體成粉末狀，然后按照文獻(xiàn)[12]的方法提取真菌DNA.

ITS序列擴(kuò)增和測(cè)定：采用通用引物ITS1, ITS4擴(kuò)增ITS 序列，按常規(guī)的50μL 體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增.反應(yīng)結(jié)束后取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).對(duì)檢測(cè)為好的PCR產(chǎn)物再次進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后切膠回收PCR產(chǎn)物，用pMD218T試劑盒將產(chǎn)物連接到pMD218TVector上，進(jìn)行測(cè)序.測(cè)序結(jié)果采用BLAST分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 恒山黃芪內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

采用上述方法從恒山黃芪根、莖、葉中共獲得49株內(nèi)生真菌，從黃芪的根部分離得到28株內(nèi)生真菌，占總菌株的57.14%；莖中分離出15株內(nèi)生真菌，占總菌株的30.62%，；而葉中只分離出6株內(nèi)生真菌，占總菌株的12.24%.

2.2 恒山黃芪具抗菌活性內(nèi)生真菌的篩選結(jié)果

采用菌餅法，對(duì)分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行抗菌活性篩選.篩選出9株高抗菌活性的菌株，編號(hào)分別是：AR02，AR03，AR08，AR14，AR25，AS02，AS05，AS09，AL05.對(duì)各指示菌的抗性結(jié)果如表1.從表1可以看出，9株內(nèi)生真菌對(duì)所有的測(cè)試菌都有抗性，對(duì)測(cè)試細(xì)菌均顯示出很強(qiáng)的抑制作用.其中，AR02，AR08和AR25對(duì)部分植物病原真菌顯示出強(qiáng)的抑制作用.AR08不僅僅抗菌譜最廣，而且抗菌活性最強(qiáng)，AR02和AR25次之，因此我們選擇編號(hào)AR08的內(nèi)生真菌作為目標(biāo)菌株.

表1 內(nèi)生真菌的抑制效果

注：①A表示黃芪，L表示葉部；②-：0<Φ(平均抑菌圈直徑) <6 mm； +：6 mm≤Φ<10 mm； ++：10 mm≤Φ<16 mm；+++：16 mm≤Φ<26 mm； ++++：Φ≥26 mm；③B1金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，B2枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis(Ehrenberg)Cohn)，B3大腸桿菌(Escherichiacoli)，B4綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)，P1番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)，P2白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)，P3辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)，P4煙草赤星病菌(Alternariaalternata)，P5蘋果腐爛病菌(Valsamali)、P6西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum).

2.3 菌株AR08的鑒定

菌株AR08的形態(tài)特征(圖1)：參照《真菌鑒定手冊(cè)》，對(duì)AR08進(jìn)行分類鑒定：有性孢子不發(fā)生，歸屬于半知菌類；分生孢子梗外露，子實(shí)體無一定的界限，絨毛狀，歸屬于叢梗孢目；菌絲表面凝集有色物質(zhì)，有隔膜，分生孢子梗不分枝，頂端膨大成球狀，分生孢子串生，無色，球形或卵圓形，歸屬于叢梗孢科曲霉屬.因此，AR08歸屬為叢梗孢目Moniliales、叢梗孢科Moniliaceae、曲霉屬Aspergillussp.中的一種.

菌株分子生物學(xué)鑒定：采用通用的18 S，28 S上保守的序列進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，經(jīng)過BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該菌與Aspergillusfumigatus的同源性達(dá)100%.

結(jié)合形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，鑒定該菌為半知菌亞門，絲孢綱，叢梗孢目，曲霉屬Aspergillusfumigatus.

圖1 內(nèi)生真菌AR08的顯微形態(tài)(×40)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從恒山黃芪根、莖、葉中分離得到49株內(nèi)生真菌.經(jīng)過抗菌活性測(cè)試，篩選出1株抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)的恒山黃芪內(nèi)生真菌AR08，鑒定為Aspergillusfumigatus.它對(duì)金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、番茄灰霉病菌、白菜黑斑病菌、辣椒疫霉病菌、煙草赤星病菌、蘋果腐爛病菌和西瓜枯萎病菌均表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性，顯示出這株內(nèi)生真菌的開發(fā)潛力，其可以成為新的抗生素的重要來源.

[1] Petrini O. Fungal endophytes of tree leave. In: Andrews J H, Hirano S S. Microbial Ecology of Leaves. New York: Springer-Verlag.1991,179-197.

[2] 戈惠明，譚仁祥. 共生菌-新活性天然產(chǎn)物的重要來源[J].化學(xué)進(jìn)展，2009,21(1)：30-46.

[3] 馬養(yǎng)民，趙 潔.植物內(nèi)生真菌抗菌活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 有機(jī)化學(xué)，2010，30(2)：220-232

[4] 周 鳳，張弘弛，劉 瑞，等.恒山黃芪內(nèi)生真菌Aspergillus sp.代謝產(chǎn)物的分離和生物活性的測(cè)定[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(4)：125-128.

[5] 中國藥典[S]．一部．2005：212．

[6] 吳發(fā)寶，陳希元.黃芪藥理作用研究綜述[J]. 中藥材，2004，27(3)：232-234.

[7] 周 鳳，張弘弛，劉 瑞，等.恒山黃芪內(nèi)生真菌分離鑒定及抗菌活性的研究[J]. 食品科技，2012 ,37 (1) :21-25.

[8] Sturz A V. Biodiversity of endophytic bacteria which colonize red clover nodules ,roots, stems and foliage and their influence on host growth[J]. Plant Pathology. 1997,48:360-369.

[9] Mclnroy. Survey of indigenous bacterial endophytes from cotton and sweetCorn[J]. Plant and soil.1995,173:337-342.

[10] 施巧琴，吳松剛.工業(yè)微生物育種學(xué)(第二版)[M].北京：科學(xué)出版社，2003：69-72.

[11] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1982：129-649.

[12] Wirsel S, Turgeon B G, YoderO C. Deletion of the Cochliobolus heterostrophus mating-type (MAT) locus promotes the function of MAT transgenes[J]. Current Genetics, 1996, 29: 241-249.