截短側(cè)耳素制備方法的研究概況

金學(xué)平 吳旭乾 阮建兵 周佳麟 梅春秋 牛克勤

武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院環(huán)境與生化工程系，湖北武漢 430205

2007年葛蘭素史克（GSK）公司在美國和歐盟成功上市截短側(cè)耳素類人用抗生素瑞他莫林（retapamulin，1），使得截短側(cè)耳素（pleuromutilin，2）的市場需求不斷增加（圖1~2）。目前市場上銷售截短側(cè)耳素的規(guī)格有85%、92%、95%三種純度。銷售市場占8%的截短側(cè)耳素直接作為添加劑使用，89%用于衍生物的制造，3%用作其他。中國市場調(diào)查研究中心數(shù)據(jù)顯示，國內(nèi)截短側(cè)耳素的銷售收入2006年37 932萬元；2007年42 678萬元；2008年46 701萬元；2009年達(dá)到53 367萬元，同比增長14.27%。隨著截短側(cè)耳素衍生物開發(fā)研究的不斷深入，帶來了截短側(cè)耳素強(qiáng)勁的市場需求，使得截短側(cè)耳素的制備方法研究備受關(guān)注。

圖1 retapamulin，1

圖2 pleuromutilin，2

1 截短側(cè)耳素的生物合成

截短側(cè)耳素屬雙萜類化合物，而萜類化合物的生物合成通常是從乙酰輔酶A開始途經(jīng)羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）和二羥甲基戊酸（MVA）進(jìn)入異戊二烯（IPP）前體合成；IPP與DMAPP（dimethylallyl pyrophosphate）形成單萜的前體物質(zhì)GPP（geranyl diphosphate），再經(jīng)縮合和異構(gòu)形成倍半萜和二萜前體物質(zhì)FPP（farnesyl diphosphate）和GGPP（geranylgeranyl diphosphate）。GGPP是截短側(cè)耳素生物合成的前體，GGPP在二萜環(huán)化酶的作用下形成三環(huán)結(jié)構(gòu)的中間產(chǎn)物，這一步是該途徑的限速步驟，二萜環(huán)化酶是一種限速酶，不同二萜環(huán)化酶所存在的差異使得該萜類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)有所不同；三環(huán)結(jié)構(gòu)的中間體經(jīng)細(xì)胞色素P450氧化酶引入C3羰基、C11羥基，然后再經(jīng)?；D(zhuǎn)移酶接上C14的?；鶊F(tuán)，最終得到截短側(cè)耳素（圖 3）。

圖3 截短側(cè)耳素的生物合成過程

2 截短側(cè)耳素的發(fā)酵過程

截短側(cè)耳素主要采用靜置發(fā)酵或者深層液體發(fā)酵方法制備。截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌有側(cè)耳屬（Pleurotus sp.）和斜蓋菇屬（Clitopilus sp.）中的部分菌種，常用菌株為P.mutilus和P.passeckerianus。靜置發(fā)酵時(shí)采用的玉米漿培養(yǎng)基，培養(yǎng)4周后，收取表層菌絲體，用葡萄球菌進(jìn)行活性測定，發(fā)現(xiàn)P.mutilus菌液達(dá)到512稀釋單位/mL，P.passeckerianus為256稀釋單位/mL。深層液體發(fā)酵時(shí)，P.mutilus培養(yǎng)10 d，活性就可達(dá)到256稀釋單位，而P.passeckerianus活性較低，只有8稀釋單位。深層液體發(fā)酵時(shí)，葡萄糖的消耗約在72 h達(dá)到低點(diǎn)，氮源的消耗情況和碳源消耗類似。產(chǎn)物的產(chǎn)量從發(fā)酵開始逐天增加，在144 h開始逐漸達(dá)到穩(wěn)定，產(chǎn)物最大量約為2.2 mg/mL。

為了提高截短側(cè)耳素的產(chǎn)量，主要圍繞菌種改良、發(fā)酵優(yōu)化、誘導(dǎo)因子和分離純化幾方面展開研究工作。從分子水平上對菌體進(jìn)行改良的研究時(shí)有報(bào)道，但未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，截短側(cè)耳素二萜環(huán)化酶基因克隆及功能研究是重要的技術(shù)瓶頸。李冰[1]報(bào)道稱國外有科學(xué)家對截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌Clitopilus passeckerianus的遺傳表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了初步的研究。誘變育種是常用的菌種選育方法，Papa等[2]用0.15 mg/mL亞硝基胍（NTG）對截短側(cè)耳素產(chǎn)菌Clitopilus passeckerianus進(jìn)行誘變所得最高產(chǎn)量與親代相比提高了89.36%。陳曉麗等[3]對截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌Clitopilus prunulus-04用NTG進(jìn)行誘變，篩選得到的突變子pn163的截短側(cè)耳素產(chǎn)量最高，比出發(fā)菌株提高了38.5%，且遺傳穩(wěn)定性好。黃宇琪等[4]在實(shí)驗(yàn)室分離并初步鑒定P4-04為產(chǎn)截短側(cè)耳素的斜蓋菇屬的新種，在以果糖為碳源、以黃豆粉餅為氮源、添加硫酸鐵等條件下產(chǎn)量比原始條件下提高73.1%。

微生物發(fā)酵優(yōu)化常用的策略是傳質(zhì)優(yōu)化和補(bǔ)料優(yōu)化。產(chǎn)生菌擔(dān)子菌形狀為菌絲狀，高速攪拌和高通氣量可能會對菌絲損傷較大，而過小則可能導(dǎo)致供養(yǎng)不足，影響發(fā)酵過程，應(yīng)該從攪拌漿的類型和轉(zhuǎn)速、通氧量等優(yōu)化傳質(zhì)條件。補(bǔ)料優(yōu)化策略有：直接反饋控制補(bǔ)料速率法是基于pH或者溶解氧（DO）的變化超過預(yù)定值以后，系統(tǒng)自動或者人工調(diào)節(jié)補(bǔ)料速率，改善發(fā)酵過程；預(yù)定速率補(bǔ)料法是假設(shè)菌體在一定的時(shí)間范圍內(nèi)指數(shù)增加，從而補(bǔ)給指數(shù)增加培養(yǎng)基，以滿足生長的需要；底物反饋補(bǔ)料法如通過在線或者離線的方法定期檢測發(fā)酵罐內(nèi)殘?zhí)菨舛?，?dāng)其不足的時(shí)候給予補(bǔ)充，使其濃度在一定的范圍內(nèi)；帶放料的補(bǔ)料方法，陳劍慧等[5]采用在210～230、240～260、270～290 h等不同發(fā)酵時(shí)間階段實(shí)施放料10%，補(bǔ)料玉米漿和豆餅粉，流加葡萄糖的方法控制發(fā)酵過程，可使效價(jià)達(dá)到10 000～ 11 000 μ/mL；發(fā)酵指數(shù)為 0.036十億 /（m3·h），發(fā)酵罐利用率可達(dá)到95%～105%。

促進(jìn)生物合成的誘導(dǎo)因子主要有添加前體、光照等。適量的抗真菌藥在適當(dāng)時(shí)間添加可有效促進(jìn)抗生素的生物合成，陳曉麗等[3]用制霉菌素、特比萘酚、十二烷基苯磺酸鈉和十二烷基三甲基氯化銨進(jìn)行抗性突變子篩選獲得了大量產(chǎn)量提高的突變子。制霉菌素和特比萘酚抗性突變子的正突變率較高，如12 μg/mL的鹽酸特比萘酚在48 h可以有效調(diào)控截短側(cè)耳素生物合成，經(jīng)7 L發(fā)酵罐放大驗(yàn)證表明較為穩(wěn)定。

3 截短側(cè)耳素的分離純化

截短側(cè)耳素的分離純化方法主要有溶劑提取法、超臨界法、膜過濾法。目前截短側(cè)耳素分離純化多采用溶劑提取法，胡昌華等[6]從截短側(cè)耳素的全發(fā)酵液中分離出菌絲體，經(jīng)干燥、粉碎、過篩，烘焙至含水量低于5%，烘焙菌絲體用醋酸丁酯浸提，過濾水洗濾液，干燥脫色，回收溶劑，靜置析晶得截短側(cè)耳素；胡江林等[7]將截短側(cè)耳素的干菌絲用甲基異丁基甲酮浸取得粗品，再用甲醇溶解后先后用石油醚和乙酸丁酯萃取，經(jīng)濃縮、結(jié)晶，乙醚洗滌、脫色得成品；Rees MJ[8]報(bào)道了甲基異丁基甲酮一步法對截短側(cè)耳素的提取純化方法，但該法溶劑使用量大，生產(chǎn)成本高；張翔等[9]分別用冰醋酸、丙酮、正己烷、無水乙醇、甲醇、水、甲基異丁基甲酮、醋酸丁酯、醋酸乙酯、二氯甲烷和三氯甲烷作為萃取溶劑，對截短側(cè)耳素的全發(fā)酵液的干菌絲進(jìn)行浸提對照試驗(yàn)，同時(shí)采用單因素實(shí)驗(yàn)法從提取時(shí)間、液料比、轉(zhuǎn)速、提取次數(shù)等幾方面考察其對提取率的影響，在此基礎(chǔ)上重點(diǎn)對醋酸丁酯浸提法進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取條件，使截短側(cè)耳素醋酸丁酯浸提法的提取率達(dá)到94.56%。

謝昌賢等[10]將烘焙菌絲體置于超臨界萃取罐中，在壓力12～24 MPa，溫度35～55℃，二氧化碳流速為25 kg/h條件下，萃取60～100 min，然后收集萃取物，經(jīng)處理后得截短側(cè)耳素。該工藝提取時(shí)間短，產(chǎn)物雜質(zhì)少，溶劑使用量小。

王素霞等[11]將截短側(cè)耳素菌絲體與甲醇或乙醇混合，在20～40℃下持續(xù)攪拌3～6 h，將浸提液在一定壓力下通過密封式無機(jī)膜過濾，濾液送入后續(xù)加工，部分殘液返回浸提罐，另一部分經(jīng)循環(huán)泵通過無機(jī)膜循環(huán)過濾，該工藝過程比傳統(tǒng)板框過濾工藝每天縮短6～10 h，收率提高5%～7%，減少了溶劑的揮發(fā)，改善了生產(chǎn)環(huán)境。

日本住友制藥公司開發(fā)的水溶性好，代謝穩(wěn)定的截短側(cè)耳素類新衍生物，N abriva和GSK制藥公司的口服妙林類抗生素相繼進(jìn)入臨床，國內(nèi)上海藥物所楊玉社等、南通大學(xué)王新楊等在新型截短側(cè)耳素衍生物的開發(fā)取得了階段性成果，預(yù)示著這類化合物良好的開發(fā)前景，直接刺激截短側(cè)耳素原料藥的產(chǎn)量需求。目前國內(nèi)外對截短側(cè)耳素原料藥的制備方法報(bào)道較少，國內(nèi)傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝存在能耗大、成本高、污染環(huán)境等問題，優(yōu)化截短側(cè)耳素的生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本是攻關(guān)的重點(diǎn)，在產(chǎn)生菌的選育、發(fā)酵過程控制和分離純化方法等環(huán)節(jié)需要進(jìn)行深入研究，尤其是在分子水平上菌種選育工作更需加強(qiáng)，以提高截短側(cè)耳素原料藥的質(zhì)量和產(chǎn)量，滿足當(dāng)前和未來市場之需求。

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