MHV-3誘導(dǎo)的小鼠病毒性肝炎模型腎臟中IL-17A表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

陸玉蕾 林有智 朱 琳 王曉晶 嚴(yán)偉明 寧 琴▲

1.華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院感染性疾病研究所、感染病科，湖北武漢 430030；

2.華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院肝臟外科實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430030

肝炎病毒感染能夠?qū)е露喾N腎臟疾病，引起腎臟損傷。在亞洲國家，乙型肝炎病毒是膜性腎小球腎炎、膜增生性腎小球腎炎和IgA腎病的常見病因之一。丙型肝炎病毒是冷球蛋白血癥介導(dǎo)的腎小球腎炎的主要致病原[1]。但是肝炎病毒引起腎臟損傷的致病機(jī)制目前尚未完全清楚。本研究用3型鼠肝炎病毒（3 types of mouse hepatitis virus，MHV-3）感染 C3H/HeJ小鼠后建立了小鼠病毒性肝炎模型[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)在該模型中存在腎組織的損傷[3]。本研究通過觀察該模型中腎臟白細(xì)胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）的表達(dá)情況，分析細(xì)胞因子IL-17A在肝炎病毒引起腎臟損傷發(fā)生、發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 MHV-3為本研究室保存病毒株，分裝凍存于-170℃液氮中。使用滴度為1×106pfu/mL。

1.1.2 動(dòng)物模型 6～8周齡（18～20 g）雌性SPF級C3H/HeJ小鼠購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，購回后飼養(yǎng)在動(dòng)物房潔凈層柜（IVC系統(tǒng)）內(nèi)，恒溫、恒濕條件下自由攝取食物和水。小鼠隨機(jī)分為兩組：模型組和對照組各50只。模型組小鼠腹腔注射200 μL含10 pfu MHV-3的生理鹽水液，對照組小鼠腹腔注射200 μL PBS液。在注射前（第0天）和注射后的第5、10、15天分批收集兩組小鼠肝臟組織標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 用LSAB法，3 μm厚腎組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2處理內(nèi)源性過氧化物酶，抗原熱修復(fù)并封閉后，加入一抗：IL-17A（Santa cruze），4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h，滴加試劑SABC 37℃孵育1 h，加入增敏二氨基聯(lián)苯胺（DAB）液，顯微鏡下控制顯色，蘇木紫復(fù)染，梯度酒精脫水干燥，性樹膠封固。同時(shí)采用Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBS）代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 腎臟組織中L-17A mRNA的檢測 采用Trizol法提取總RNA，取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real time PCR 反應(yīng)：（1）IL-17A引物上游序列：5’-GGCTGACCCCTAAGAAACC-3’；下游序列：5’-CTGAAAATCAATAGCACGAAC-3’，（2）mGAPDH引物上游序 列：5’-CTCATGACCACAGTCCATGCCATC-3’；下游序列：5’-CTGCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’。具體反應(yīng)步驟：95℃預(yù)變性 2 min，95℃ 20s，57℃ 30s，72℃ 30s共 40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料用（x ± s）的形式表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功建立實(shí)驗(yàn)性小鼠病毒性肝炎模型

模型組肝臟組織有大量的淋巴細(xì)胞以及少量的中性粒細(xì)胞的浸潤；感染后3 d開始出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫、氣球樣變、點(diǎn)狀壞死、灶狀壞死甚至碎片狀壞死，以感染后第10天最為嚴(yán)重。而對照組肝組織結(jié)構(gòu)基本正常。

2.2 腎臟組織的病理改變

病理結(jié)果顯示，光鏡下感染MHV-3后模型組大量腎小管上皮細(xì)胞腫脹壞死，腎間質(zhì)嚴(yán)重充血，有大量炎性細(xì)胞浸潤。而對照組腎臟組織結(jié)構(gòu)基本正常。見圖1。

A：對照組小鼠腎臟組織；B：感染MHV-3第10天模型組腎臟組織圖1 MHV-3感染對小鼠腎組織病理改變的影響（HE染色×400）

2.3 MHV-3誘導(dǎo)的小鼠病毒性肝炎模型腎臟組織中IL-17A的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，感染MHV-3 10 d后，小鼠腎臟組織中表達(dá)IL-17A，可見近曲小管和腎間質(zhì)出現(xiàn)IL-17A較強(qiáng)陽性著色，見圖2。隨著MHV-3感染時(shí)間的延長，腎臟組織IL-17AmRNA水平較第0天逐漸升高（P＜0.05），在MHV-3感染后第10天達(dá)到高峰（8.31±2.72），見表1。

A：對照組小鼠腎臟組織；B：感染MHV-3第10天腎臟組織圖2 IL-17A在MHV-3誘導(dǎo)的小鼠病毒性肝炎模型腎臟組織中的表達(dá)（DAB顯色，×200）

表1 IL-17A在MHV-3誘導(dǎo)的小鼠病毒性肝炎模型腎臟組織中的表達(dá)變化（x ± s）

3 討論

IL-17A是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型促炎性細(xì)胞因子。IL-17A被證實(shí)可以促進(jìn)IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、前列素E2和基質(zhì)金屬蛋白酶等的表達(dá)，參與多種炎性反應(yīng)過程，引起炎性細(xì)胞浸潤和組織損傷[4]。此外，IL-17A具有募集中性粒細(xì)胞的生物學(xué)作用，它能通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化因子的表達(dá)如CXCL1、CXCL2、CXCL8等，進(jìn)一步促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的侵潤，造成炎性反應(yīng)，并進(jìn)一步加劇組織的損傷[5]。目前大量的研究表明IL-17A和腎臟疾病密切相關(guān)，在多種腎臟疾病，如原發(fā)性腎病綜合癥（primary nephrotic syndrome，PNS）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、腎功能衰竭等病理過程中發(fā)揮了重要作用[6]。筆者研究觀察到，在MHV-3誘導(dǎo)的小鼠病毒性肝炎模型中，腎臟組織IL-17A的水平顯著增加，可以推測腎臟組織表達(dá)的IL-17A可能參與MHV-3感染引起的腎臟損傷的病理過程中。此外，IL-17A能夠促進(jìn)TNF-α的產(chǎn)生[7]，TNF-α表達(dá)的增加將進(jìn)一步加劇腎臟的損傷。綜上所述，IL-17A可能在MHV-3感染造成腎臟損傷的病理過程中發(fā)揮重要作用，但是其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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