HIF-1α在不同肝臟組織中的表達(dá)狀態(tài)研究

徐子俊 謝明均 黃 君

1.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川瀘州 646000；2.四川省宜賓市第一人民醫(yī)院外科，四川宜賓 644000

腫瘤內(nèi)的血管與正常組織中的血管在結(jié)構(gòu)和功能上均有很大的區(qū)別，其血流緩慢、不規(guī)則，輸送氧和營養(yǎng)物質(zhì)的能力差，因此會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞乏氧[1]。通常，乏氧能使腫瘤細(xì)胞的一些基因和蛋白表達(dá)發(fā)生改變，如乏氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxiainducible factor-1,HIF-1）、氧調(diào)節(jié)蛋白（oxygen regulated protein，ORP）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）、p53和血小板衍生生長因子-β等[2-3]。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亞基構(gòu)成的異二聚體。HIF-1α對氧的依賴性較強(qiáng)，既是氧調(diào)節(jié)亞基又是活性亞基，對調(diào)節(jié)微環(huán)境中的氧平衡起主要作用。由于HIF-1α基因在惡性腫瘤細(xì)胞中的特異性表達(dá)和介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長的特性，目前正成為腫瘤研究的新靶點(diǎn)[4]。原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多步驟的復(fù)雜過程。筆者以臨床肝細(xì)胞癌患者手術(shù)切除標(biāo)本為研究對象，與癌旁肝硬化組織、非癌肝硬化組織及正常肝組織作比較，通過免疫組織化學(xué)法研究肝癌組織、癌旁肝硬化組織、非癌肝硬化組織及正常肝組織中HIF-lα的表達(dá)狀態(tài)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與來源

1.1 資料收集及標(biāo)本來源

收集2009年3月~2010年9月在筆者所在醫(yī)院因診斷為原發(fā)性肝癌而行肝臟部分切除術(shù)的56例肝癌組織標(biāo)本。其中，男41例，女15例；年齡24~67歲，平均（47.8±11.2）歲。所有患者術(shù)前均未接受任何化療、放療、介入和免疫等治療。所有標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)病理學(xué)檢查證實(shí)為HCC。

同時(shí)收集合并有肝硬化背景的癌旁組織（距離癌灶邊緣1 cm的肝硬化組織）27例。其中，男19例，女8例，年齡28～63歲，平均（48.4±7.6）歲。另隨機(jī)收集因乙肝肝硬化門脈高壓癥而行門奇斷流術(shù)的非癌肝硬化組織23例。其中，男16例，女7例，年齡37～59歲，平均（43.8±6.3）歲。收集11例取自肝血管瘤周圍的正常肝組織或肝外傷后切除的肝組織作為正常對照標(biāo)本。其中，男7例，女4例，年齡19～57歲，平均（39.7±8.4）歲。每例患者標(biāo)本切下后立即經(jīng)10%中性Formalin溶液固定。經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋備用。

1.2 主要試劑

鼠抗人HIF-1 alpha IgG單克隆抗體（英國abcam公司）、SP免疫組化超敏試劑盒（Kit-9710、Kit-9709，福建福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）、DAB顯色試劑盒（DAB-0031，福建福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。表達(dá)率在組間的比較采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 免疫組織化學(xué)染色步驟

（1）取石蠟包埋的肝癌組織、癌旁肝硬化組織、非癌肝硬化組織和正常肝組織標(biāo)本分別作厚度4 μm的連續(xù)切片，每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片2張，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精逐級水化，用PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH（7.5±0.1））沖洗 3次，每次3 min。每張切片加50 μL過氧化酶阻斷溶液（endogenous peroxidase blocking solution），室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。（2） 組織抗原修復(fù)，高溫高壓3 min，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH6.0），PBS沖洗3次，每次5 min。除去PBS緩沖液，每張切片加50 μL正常非免疫動物血清（normal nonimmunone serum），室溫下孵育10 min。（3）除去血清，每張切片加50 μL的HIF-lα第一抗體（稀釋度：1︰150），4℃過夜。PBS沖洗3次，每次3～5 min。除去PBS液，每張切片滴加50 μL生物素標(biāo)記的第二抗體（HIF-lα生物素化羊抗鼠IgG），37℃孵育30 min。PBS沖洗3次，每次3 min。（4）除去PBS液，每張切片加50 μL鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液（streptavidin-peroxidase），37℃孵育 30 min。PBS沖洗3次，每次3 min。（5）除去PBS液，每張切片加100 μL新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3 min左右。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染2 min，PBS或自來水沖洗返藍(lán)。（6）切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

實(shí)驗(yàn)以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知的陽性切片作為陽性對照。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

結(jié)合病理圖像分析系統(tǒng)，由兩名未參與實(shí)驗(yàn)的病理科醫(yī)師采用盲法閱片的方式觀察所有切片。光學(xué)顯微鏡下以細(xì)胞漿和（或）細(xì)胞核內(nèi)呈清晰棕黃色或黃色細(xì)顆粒狀著色為HIF-lα蛋白表達(dá)陽性。在高倍鏡（×400倍）下對每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野作陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共計(jì)500個(gè)，結(jié)果取均數(shù)表示。參照Birner等[5]的方法，綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比的得分之和行半定量處理后進(jìn)行結(jié)果評價(jià)：（1）按細(xì)胞顯色有無及深淺記分：無染色者記0分；染色弱但明顯強(qiáng)于陰性對照者記1分；染色清晰者記2分。（2）按陽性細(xì)胞數(shù)記分：陽性細(xì)胞率＜5%者記0分；5%～25%者記1分；26%～50%者記2分；＞50%者記3分。（3）以上述兩項(xiàng)記分相加決定最終評分：0分為陰性（－）；1～2分為弱陽性（＋）；3～5分為強(qiáng)陽性（＋＋）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以O(shè)lympus DP70 BX51顯微圖像采集系統(tǒng)采集圖像。

3 結(jié)果

免疫組化染色顯示，HIF-lα蛋白在癌旁肝硬化和肝癌組織中均有表達(dá)，而在非癌肝硬化組織及正常肝組織中則表達(dá)很弱或者基本不表達(dá)。HIF-lα陽性表達(dá)呈均勻一致的棕黃色或黃色細(xì)顆粒狀染色，主要定位于胞漿及/或胞核中。見圖1～3。半定量分析顯示在肝癌組織中HIF-lα的表達(dá)率為71.4%，明顯強(qiáng)于癌旁肝硬化組織中（48.1%）的表達(dá)，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；癌旁肝硬化組織中HIF-lα的陽性表達(dá)率又強(qiáng)于非癌肝硬化組織中（17.4%）的表達(dá)，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但在非癌肝硬化組織及正常肝組織間，HIF-lα的表達(dá)則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

圖1 非癌肝硬化組織中HIF-lα表達(dá)呈陰性（DAB×400）

圖2 癌旁肝硬化組織胞核中HIF-lα呈陽性表達(dá)（DAB×400）

圖3 肝癌組織胞核及部分胞漿中HIF-lα呈陽性表達(dá)（DAB×400）

表1 HIF-lα在4種肝臟組織中陽性表達(dá)率的比較

4 討論

局部微環(huán)境缺氧是許多實(shí)體性腫瘤的基本特征。機(jī)體為對抗這種缺氧的微環(huán)境，會發(fā)生一系列的適應(yīng)性改變，腫瘤細(xì)胞的基因組/蛋白組也發(fā)生變異，表現(xiàn)出某些新的生物學(xué)性狀[6]。20世紀(jì)90年代，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室在研究促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞株Hep 3B表達(dá)一種DNA結(jié)合蛋白，它能與EPO基因的增強(qiáng)子序列結(jié)合，上調(diào)EPO的基因轉(zhuǎn)錄。Semenza等[7]從人的EPO基因3’-側(cè)翼序列證實(shí)了一種502核苷酸增強(qiáng)子，對由缺氧誘導(dǎo)并進(jìn)而能激活和放大轉(zhuǎn)錄的結(jié)合位點(diǎn)作出了界定，并將這一由缺氧誘導(dǎo)的核因子命名為缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）。

HIF-1由α亞基和β亞基構(gòu)成。HIF-1α是調(diào)節(jié)亞單位，決定HIF-1的活性。常氧狀態(tài)下，細(xì)胞雖然不斷地合成HIF-1α，但由于它受泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system）的作用而迅速被降解，很難檢測到[8]。缺氧狀態(tài)下，HIF-1α的泛素化急劇減少，并從胞漿轉(zhuǎn)位至胞核內(nèi)，與HIF-1β結(jié)合形成異二聚體，成為有活性的HIF-1復(fù)合物，再結(jié)合到其靶基因的啟動子或增強(qiáng)子的缺氧反應(yīng)元件（hypoxia response element，HRE）上，從而可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控諸多靶基因的表達(dá)，參與維持細(xì)胞、組織、機(jī)體氧平衡的各種基因的轉(zhuǎn)錄[9]。HIF-1α的過表達(dá)已有報(bào)道見于多種惡性腫瘤甚至癌前病變中[10]。Zhong等[11]利用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析了19種類型179例腫瘤標(biāo)本中HIF-1α的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、腦瘤、腎癌及黑色素瘤等腫瘤細(xì)胞中，均可見HIF-1α呈不同程度的表達(dá)，其中結(jié)腸、前列腺及乳腺的癌前病變中發(fā)現(xiàn)了HIF-1α呈陽性表達(dá)，而在腫瘤旁的正常組織及相應(yīng)的良性病變中則未檢測到HIF-1α表達(dá)，因此認(rèn)為HIF-1α的表達(dá)與腫瘤的良惡性有明顯關(guān)系，在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。

本研究運(yùn)用特異性單克隆抗體進(jìn)行的免疫組織化學(xué)方法檢測了肝細(xì)胞癌組織、癌旁肝硬化組織、非癌肝硬化組織及正常肝組織中HIF-lα的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-lα在肝細(xì)胞癌及癌旁肝硬化組織中的表達(dá)普遍較高，而非癌肝硬化組織及正常肝組織中HIF-lα表達(dá)極弱或幾乎不表達(dá)。這說明肝細(xì)胞癌組織及其附近的癌旁肝硬化組織中均存在著缺氧現(xiàn)象。但是，肝癌組織中HIF-lα的表達(dá)水平明顯高于癌旁肝硬化組織，從而說明肝癌細(xì)胞的缺氧更形嚴(yán)重。HCC通常由慢性肝硬化發(fā)展而來，肝臟的慢性損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞性狀的改變繼而引起肝組織硬化，并破壞肝內(nèi)正常的血供系統(tǒng)，導(dǎo)致肝供血不足、肝組織內(nèi)缺氧。而且，隨著腫瘤細(xì)胞的高度增殖、數(shù)量增多、腫瘤體積增大，也引起肝癌組織內(nèi)更加嚴(yán)重的缺氧[12]。肝組織的缺血、缺氧使HIF-lα的表達(dá)上調(diào)。本研究中，筆者將癌旁的和非癌的肝硬化組織進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)同樣是肝硬化組織，但癌旁肝硬化組織中HIF-lα的表達(dá)水平明顯高于非癌肝硬化組織，而在非癌肝硬化組織與正常肝組織中HIF-lα的表達(dá)水平則無顯著性差異。這說明癌旁肝硬化組織中HIF-lα的高表達(dá)可能仍然是受肝細(xì)胞癌本身的影響的，癌變的肝組織及其附近的肝硬化組織均存在著不同程度的缺氧微環(huán)境。癌巢周圍的結(jié)締組織增生以及組成梁索的細(xì)胞層次增加也能造成細(xì)胞的缺氧微環(huán)境。HIF-lα通路參與了細(xì)胞對缺氧的適應(yīng)，因此，肝癌細(xì)胞和癌旁肝硬化中的肝細(xì)胞能通過此機(jī)制在缺氧環(huán)境下存活。由此可以設(shè)想，使用特異性抗HIF-lα抗體抑制HIF-lα的過度表達(dá)，可能會阻止肝癌的發(fā)生發(fā)展。

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