pIRES-IL-24-PTEN雙表達載體的構建及鑒定

丁嵩濤 彭惠民 周宇箭 劉含登

重慶醫(yī)科大學實驗教學中心，重慶 401331

腫瘤是威脅人類健康的一大疾病，手術、放療、化療等傳統(tǒng)治療方法對中晚期及轉移性腫瘤療效較差。近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，基因治療已經(jīng)運用于臨床，然而腫瘤是一種多基因疾病，運用單一基因進行治療往往達不到預期效果。因此同時運用多種基因聯(lián)合治療，基因治療聯(lián)合放療化療治療腫瘤疾病成為近年來研究的熱點[1]。

白細胞介素24（IL-24）屬于白介素10（IL-10）細胞因子家族。研究發(fā)現(xiàn)，IL-24能夠抑制多種腫瘤細胞增殖及誘導其凋亡，并且對正常細胞沒有明顯毒副作用[2]。PTEN是一種抑癌基因，其缺失與突變和腫瘤的生長、侵襲、轉移密切相關。腫瘤細胞中過量表達PTEN能夠引起腫瘤細胞凋亡，阻滯細胞周期，抑制腫瘤細胞生長和遷移[3]。

本實驗通過將IL-24和張力蛋白同源基因（PTEN）兩種不同作用途徑的抑癌基因使用pIRES質粒構建雙基因共表達載體，將重組共表達質粒pIRES-IL-24-PTEN轉入腫瘤細胞，觀察IL-24和PTEN表達情況，從而為探討上述兩種基因聯(lián)合治療腫瘤疾病的可能性及進一步研究其信號通路及抗癌機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 一般材料

限制性內切酶（Nhe Ⅰ，MluⅠ，XbaⅠ，NotⅠ），T4 DNA連接酶，DL2000 marker，pMD18-T載體，PCR試劑盒購自TAKARA公司，膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，引物由上海生物工程公司合成，pIRES載體購自Clontech公司，脂質體轉染試劑盒購自Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，小鼠抗人PTEN抗體和兔抗人IL-24抗體及HRP標記的二抗購自Santa Cruz公司，大腸桿菌DH5α，A549細胞，pGEX-IL-24質粒和pcDNA3.0-PTEN質粒為本室保存。

1.2 PCR擴增IL-24和PTEN基因片段

通過PCR方法從pGEX-IL-24質粒和pcDNA3.1-PTEN質粒擴增帶有NheⅠ和MluⅠ酶切位點的IL-24片段以及帶有XbaⅠ和NotⅠ酶切位點的PTEN片段，根據(jù)IL-24和PTEN報道序列設計引物，引物為：IL-24sense：5’-CGGCTAGC ATGAATTTTCAACAGAGGCTGCA-3’ IL-24antisense：5’-CGACGCGTTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG-3’ PTENsense：5’-GCTCTAGACATGACAGCCATCATCAAAGAG-3’PTENantisense：5’-GTGCGGCCGCTTCAGACTTTTGTAATTTGTGT-3’ （劃線部分為NheⅠ，MluⅠ，XbaⅠ，NotⅠ的酶切位點），反應體系：模板 2μL，10×Buffer2μL，dNTPs0.5μL，上下游引物各0.5μL，Taq酶0.25μL，滅菌水補充反應體系至20μL。反應參數(shù)：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，退火30 s（IL-24退火溫度：59℃；PTEN退火溫度：55℃），72℃延伸1 min，經(jīng)過30次循環(huán)后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收純化后連接至pMD18-T載體，轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落提取質粒，酶切鑒定并送測序，測序正確的質粒命名為pMD18-IL-24和pMD18-PTEN。

1.3 構建pIRES-IL-24-PTEN載體

NheⅠ和MluⅠ雙酶切pMD18-IL-24質粒和pIRES質粒，膠回收試劑盒分別回收目的片段，使用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物純化后轉化DH5α大腸桿菌，挑取陽性菌株進行酶切鑒定。鑒定正確的菌株提取質粒，用XbaⅠ和NotⅠ雙酶切，同時pMD18-PTEN質粒進行XbaⅠ，NotⅠ雙酶切，膠回收目的片段，使用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉化DH5α大腸桿菌，篩選陽性克隆提取質粒進行酶切鑒定，并送測序，測序正確的菌株擴大培養(yǎng)，提取質粒并測OD260和OD280值，檢測質粒純度，同時檢測質粒濃度。

1.4 A549細胞的培養(yǎng)和轉染

復蘇的A549細胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基于5%CO2、37℃、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，傳2代后將細胞以0.6×105個/孔傳代于24孔板，使用無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞達到90%~95%融合，按照LipofectamineTM 2000轉染試劑盒操作說明，質粒與脂體按1︰2.5比例轉染。

1.5 IL-24和PTEN的表達和檢測

轉染后48 h收集細胞，蛋白裂解液裂解細胞，提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離后使用Tank法轉移至PVDF膜，封閉后分別加入小鼠抗人PTEN抗體和兔抗人IL-24抗體，洗膜，加入HRP標記的二抗，DAB顯色。

2 結果

2.1 IL-24和PTEN基因片段的擴增

以pGEX-IL-24質粒和pcDNA3.1-PTEN質粒為模板，用引入雙酶切位點的IL-24引物和PTEN引物分別進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約640 bp和1 200 bp處分別得到清晰條帶，與IL-24和PTEN基因大小相符。見圖1。

M：DNA marker（DL2000）；1：IL-24 PCR產(chǎn)物；2：PTEN PCR 產(chǎn)物圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析IL-24和PTEN基因PCR擴增產(chǎn)物

2.2 pIRES-IL-24-PTEN載體的構建

pIRES載體連接上IL-24和PTEN基因片段后分別進行NheⅠ，MluⅠ雙酶切和XbaⅠ，NotⅠ雙酶切鑒定，在約640bp處和1 200 bp處得到清晰條帶，證明IL-24和PTEN基因片段已連接入載體，pIRES-IL-24-PTEN載體構建成功。見圖2。

M：DNA marker（λ-EcoT14 I）；1：pIRES-IL-24-PTEN經(jīng)Xba I和Not I雙酶切；2：pIRES-IL-24-PTEN經(jīng)Nhe I和Mlu I雙酶切圖2 pIRES-IL-24-PTEN酶切電泳鑒定結果

2.3 Western blot檢測IL-24和PTEN蛋白的表達

pIRES-IL-24-PTEN載體轉染A549人肺癌細胞48 h后，收集細胞，提取總蛋白進行Western blot鑒定。結果可見轉染質粒組出現(xiàn)IL-24和PTEN特異性條帶和β-actin條帶，未轉染質粒組未出現(xiàn)IL-24和PTEN條帶，只有β-actin條帶出現(xiàn)，證明轉染pIRES-IL-24-PTEN的A549細胞有IL-24和PTEN蛋白表達。見圖3。

1：未轉染pIRES-IL-24-PTEN載體；2：轉染pIRES-IL-24-PTEN載體圖3 Western blot法鑒定IL-24和PTEN基因在肺癌A549細胞中的表達

3 討論

IL-24又名黑色素瘤分化相關基因7，具有多種生物學活性，可抑制多種腫瘤細胞生長并誘導其快速凋亡，抑制腫瘤血管生成，抑制腫瘤侵襲和轉移，并具有免疫調節(jié)功能[4]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-24通過多種信號通路特異誘導腫瘤細胞凋亡，其中包括：通過激活雙鏈RNA依賴的蛋白激酶（PKR）信號途徑，激活其下游因子eIF2α，Tyk2，p38MAPK，阻止細胞內蛋白合成，從而抑制腫瘤細胞生長并誘發(fā)凋亡[5]；與BiP/GRP78結合，誘發(fā)未折疊蛋白反應（Unfolded Protein Response），激活p38 MAPK信號通路，上調GADD基因表達[6]；通過改變促凋亡蛋白（Bax，Bad，Bak和 Bcl-xS）和抗凋亡蛋白（Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-W，Mcl-1）的比例誘導腫瘤細胞凋亡[7]。

PTEN是一種腫瘤抑制因子，其突變和缺失與多種腫瘤的發(fā)生密切相關[8]。細胞內過量表達的PTEN具有抗腫瘤活性，可以通過拮抗PI3K-PKB/AKT信號途徑，抑制腫瘤細胞生長，促進其凋亡[9]；同時還可以抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移并抑制腫瘤血管新生[10]。除此之外，PTEN還具有多種重要的生物學功能，如：PTEN可導致細胞周期阻滯在G0/G1期，說明其具有抑制細胞生長的功能[11]；細胞核中PTEN主要維持基因組穩(wěn)定并與染色質功能相關。研究還發(fā)現(xiàn)PTEN定位于著絲粒并與著絲粒蛋白C相結合，從而保持染色體的完整[12]。cDNA微陣列探針研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因突變的細胞會發(fā)生廣泛的基因表達譜改變，說明PTEN可能參與基因轉錄調節(jié)[13]。

進一步的cDNA微陣列探針研究發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌中由腺病毒介導表達IL-24可引起腫瘤抑制基因PTEN表達增加并抑制PI3K信號途徑，說明IL-24和PTEN在信號通路上有關聯(lián)[14]，還需要進一步研究以揭示以上兩種抑癌基因的信號通路及相互作用。

內部核糖體進入位點（IRES）來源于病毒和真核細胞mRNA 的5’端非翻譯區(qū)，具有不依賴于5’帽子結構而募集核糖體并啟動下游基因翻譯的功能[15]。運用IRES構建雙基因或多基因表達載體可以同時研究多種基因的相互作用及功能。本實驗運用含有IRES位點的pIRES載體成功構建了pIRES-IL-24-PTEN雙表達載體，可用于聯(lián)合表達IL-24和PTEN基因，為進一步研究其協(xié)同抗癌作用及抗癌機理提供了實驗基礎。

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