Treg細(xì)胞與白癜風(fēng)的相關(guān)性研究

楊曉晶

解放軍第一○五醫(yī)院皮膚科，安徽合肥 230031

白癜風(fēng)是一種以色素脫失為主要表現(xiàn)的獲得性皮膚疾病。近年研究發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)患者存在免疫功能紊亂，CD4+CD25+Treg含量可發(fā)生明顯變化，筆者所在醫(yī)院對(duì)2010～2011年來(lái)院就診的40例白癜風(fēng)患者進(jìn)行了Treg細(xì)胞（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）的檢測(cè)以研究其與白癜風(fēng)發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇筆者所在醫(yī)院2010年2月～2011年7月收治的白癜風(fēng)患者40例作為實(shí)驗(yàn)組，其中男23例，女17例，年齡17～68歲，平均（32.7±12.8）歲，病程2～13年。所有患者均符合白癜風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)，按照分期標(biāo)準(zhǔn)[1]屬于白癜風(fēng)進(jìn)展期的20例，穩(wěn)定期20例。對(duì)照組為40例與患者性別、年齡、BMI等匹配的健康人志愿者40例，男22例，女18例，年齡17～65歲，平均（33.4±13.1）歲。兩組患者在性別、年齡、BMI等身體條件上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

兩組患者清晨空腹肘靜脈抽血10 mL，加入EDTA抗凝管顛倒混勻，密度梯度離心法常規(guī)分離外周血單核淋巴細(xì)胞（PBMCs）。將PBMCs加入流式管，將熒光異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的鼠抗人CD4單克隆抗體和藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的鼠抗人CD25單克隆抗體各20 μL分別加入流式管，混勻避光培養(yǎng)10 min后離心棄上清。加入預(yù)冷固定液0.5 mL避光反應(yīng)20 min，加破膜劑1 mL離心棄上清。再加入PE標(biāo)記的Foxp3單克隆抗體以標(biāo)記天然型Treg（nTreg），混勻避光30 min。加破膜劑離心棄上清，D-hank液重懸，放入美國(guó)Beckmen公司制造的流式細(xì)胞儀中上機(jī)檢測(cè)。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和健康對(duì)照組樣本的 CD4+、CD25+、Foxp3+、CD4+CD25+、CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，用百分比（%）表示結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)兩組樣本結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)檢查兩組樣本間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 隨訪

對(duì)40例白癜風(fēng)患者進(jìn)行為期6個(gè)月的隨訪，隨訪其治療情況和病情進(jìn)展情況，在第12周對(duì)血清Treg細(xì)胞水平進(jìn)行復(fù)查。38例完成隨訪，其中31例定期來(lái)院復(fù)查。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各抗原和Treg細(xì)胞亞群數(shù)量情況

CD4+、CD25+、Foxp3+3種細(xì)胞數(shù)量白癜風(fēng)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)展期、穩(wěn)定期均略低于對(duì)照組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在 CD4+CD25+（Treg）細(xì)胞和 CD4+CD25+Foxp3+（nTreg）細(xì)胞兩項(xiàng)，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)展期患者均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者略低于對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組各表型細(xì)胞和CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3+nTreg細(xì)胞數(shù)量比較（%）

2.2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Treg各亞群占CD+細(xì)胞百分比比較

由 表1可 得CD4+CD25+（Treg）占CD4+細(xì) 胞 百 分 比，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)展期為4.69%，穩(wěn)定期為5.91%，對(duì)照組為8.10%。CD4+CD25+Foxp3+（nTreg）占CD4+CD25+百分比，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)展期為1.05%，穩(wěn)定期為1.47%，對(duì)照組為2.30%。兩種細(xì)胞所占CD4+細(xì)胞比例進(jìn)展期均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），穩(wěn)定期略低于對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 兩組患者隨訪結(jié)果

對(duì)40例患者進(jìn)行6個(gè)月的隨訪，對(duì)其后期病情發(fā)展情況進(jìn)行隨訪，在第12周進(jìn)行血清Treg細(xì)胞數(shù)量的復(fù)查。經(jīng)治療后，其中進(jìn)展期患者有14例轉(zhuǎn)為穩(wěn)定期，復(fù)查其血清Treg和nTreg水平為（1.62%±1.04%）和（0.41%±0.29%），比治療前的（1.38%±0.77%）和（0.31%±0.22%）顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

白癜風(fēng)是一種常見(jiàn)的獲得性表皮色素脫失性皮膚病，在我國(guó)發(fā)病率2%左右，可在皮膚上出現(xiàn)大小不等的類(lèi)圓形白斑，邊界清晰，邊緣色素較深。該病患者由于表皮色素脫失，嚴(yán)重影響了外貌美觀，產(chǎn)生心理自卑感和抑郁的情緒，對(duì)正常的生活、工作、人際交往和婚姻等均造成了嚴(yán)重的影響[2]。

白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，治療工作較為困難，目前隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展和分子水平的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的普及，國(guó)際研究顯示白癜風(fēng)的發(fā)病可能是由T細(xì)胞或天然殺傷細(xì)胞（NK）介導(dǎo)的特異性免疫效應(yīng)導(dǎo)致黑素細(xì)胞損傷[3]，即細(xì)胞免疫功能的紊亂是參與病理發(fā)展的主要機(jī)制。而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是一種能夠抑制自身免疫性T活性的細(xì)胞亞群，可以下調(diào)CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而維持免疫功能的穩(wěn)定。Treg可分為天然性（nTreg）和誘導(dǎo)性(aTreg），nTreg是一種結(jié)構(gòu)性表達(dá)的Treg細(xì)胞，在白癜風(fēng)發(fā)病過(guò)程中被認(rèn)為有重要關(guān)系[4]。其特異性抗原為Foxp3，是Treg細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄因子，2003年Rudenskv等證明Foxp3在CD4+CD25+T細(xì)胞上特異性表達(dá)，且Foxp3在Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能上是必需的[5]。通過(guò)流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)出CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞即為nTreg。

在形態(tài)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，皮損周?chē)?rùn)著CD4+和CD8+T細(xì)胞，對(duì)分離細(xì)胞的體外培養(yǎng)顯示，CD8+T細(xì)胞對(duì)自體黑素細(xì)胞具有毒性作用，可能為作用的主要細(xì)胞。有報(bào)道顯示近皮損緣的CD4+T細(xì)胞和近正常皮膚CD8+T細(xì)胞對(duì)Treg細(xì)胞的反應(yīng)性降低，CD8+的細(xì)胞毒T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，Tc）浸潤(rùn)，Tc可表達(dá)皮膚歸巢受體，在表皮駐足并發(fā)揮其細(xì)胞毒作用破壞黑素細(xì)胞，可能是引起皮膚病變的主要原因[6]。本研究顯示白癜風(fēng)患者外周血中Treg數(shù)量和nTreg數(shù)量均低于正常對(duì)照組，而且在進(jìn)展期患者尤其顯著（P＜0.05），隨訪結(jié)果顯示，經(jīng)治療好轉(zhuǎn)的患者血清Treg細(xì)胞水平顯著升高（P＜0.05），這說(shuō)明可能是由于Treg細(xì)胞的減少和活性的降低，使CD4+和CD8+T細(xì)胞的反應(yīng)活性上調(diào)，引起自身免疫性反應(yīng)，造成黑素細(xì)胞的損傷[7]，而治療后Treg水平的升高，抑制了T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。有文獻(xiàn)表明在Treg細(xì)胞在組織移植中可以減少移植組織周?chē)鶦D8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞數(shù)量，抑制移植免疫排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間[8]。

綜上所述，筆者認(rèn)為白癜風(fēng)患者體內(nèi)Treg含量降低，Treg細(xì)胞表達(dá)的減少引起CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞局部浸潤(rùn)，損傷黑素細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能紊亂，色素生成障礙可能是引起白癜風(fēng)患者色素脫失的主要原因。

[1] 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)色素病學(xué)組.白癜風(fēng)臨床分型及療效標(biāo)準(zhǔn)黃褐斑臨床診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2004，18（5）：278.

[2] 羅毅,范應(yīng)君.補(bǔ)骨脂酊聯(lián)合窄譜中波紫外線(xiàn)治療白癜風(fēng)臨床觀察[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2011，4（1）：123.

[3] 吳燕虹，楊慧蘭，李薇，等.白癜風(fēng)患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平檢測(cè) [J].廣東醫(yī)學(xué)，2008，29（3）：481-482.

[4] 李穎，徐林.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究新進(jìn)展[J].現(xiàn)代免疫，2010，30（6）：520-523.

[5] Arruvito L，Sotelo AI，Billordo A，et al.A physiological role for Inducible Foxp3 Treg cells-Lessons from women with reproductive failure[J].Clin Immunol，2010，13（6）：432-441.

[6] 李泓馨，王華，高天文.尋常型進(jìn)展期白癜風(fēng)患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)[J].臨床皮膚科雜志，2008，37（11）：714-716.

[7] 李廷慧，侯曉彬，肖漓，等.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與Foxp3表達(dá)在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2009，18（6）：819-820.

[8] 金光春，陳從容，李言君.Tregs對(duì)同種異體牙移植免疫排斥反應(yīng)的抑制作用 [J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2011，1（12）：39-41.