不對(duì)稱還原α-氨基苯乙酮菌種的篩選及轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化*

生 措 任 杰 王 敏 吳洽慶** 朱敦明**

（1天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 天津 300457）

（2中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 天津 300308）

Absttrraacctt Optically active amino alcohols are important building blocks for the synthesis of many chiral pharmaceuticals.A straightforward approach to the synthesis of these chiral amino alcohols is the biocatalytic asymmetric reduction of the corresponding prochiral ketones.Two strains were isolated from soil samples by screening using α-aminoacetophenone as the substrate, and named as 1403 and 4802.Strains 1403 and 4802 reduced α-aminoacetophenone to （R）- and （S）-αaminophenethanol with enantiomeric excess （e.e.）of 99％ and 70％, and were identif ed asFusariumsp.andGalactomycessp., respectively.The conditions for cultivation and biotransformation were optimized.The optimal cultivation time of both strains were 24 h；the optimized concentrations of substrate and resting cell were 5 g/L and 20 g/L for strain 1403 （Fusariumsp.）, 3 g/L and 80 g/L for strain 4802 （Galactomycessp.）, respectively.Two strains could also convert α-chloroacetophenone, α-bromoacetophenone, and acetophenone to the corresponding alcohols of （R）- and （S）-configuration.Moreover, when α-hydroxyacetophenone was served as substrate （S）-hydroxyphenylethanol was obtained with e.e.of 99％ for both strains.Fig 6, Tab 2, Ref 15

Keywwoorrddss asymmetric reduction；α-aminoacetophenone；α-aminophenylethanol；Fusarium sp.；Galactomycessp.

CLC Q936

手性氨基醇是一類重要的小分子，作為不對(duì)稱合成的合成砌塊廣泛用于活性化學(xué)分子特別是一些手性藥物的合成[1]，其中手性的α-氨基苯乙醇及其衍生化合物是合成許多重要藥物的關(guān)鍵中間體，常用于心血管藥物（β-受體阻滯劑）、神經(jīng)系統(tǒng)藥物（多巴、兒茶酚胺類）及其他藥物（米拉貝?。┑暮铣蒣2].近年來(lái)由于生物催化技術(shù)高效專一和綠色節(jié)能的特點(diǎn)，酶法不對(duì)稱合成這類化合物的應(yīng)用越來(lái)越受到重視[3]，潛手性芳香酮的生物催化還原是生產(chǎn)手性芳香醇的重要途徑之一.但是合成α-氨基苯乙醇大多數(shù)方法都是以其他基團(tuán)取代的苯乙酮為底物，經(jīng)生物催化還原羰基后，再經(jīng)過(guò)化學(xué)法合成得到α-氨基苯乙醇類化合物.例如：1）還原迭氮苯乙酮后經(jīng)還原取代水解[4]；2）還原羰基羧酸酯，后經(jīng)兩步反應(yīng)合成[5]；3）還原鹵代酮后經(jīng)親核取代[6]；4）首先得到腈醇，再經(jīng)腈基還原得到[7,8].而直接還原α-氨基苯乙酮得到手性α-氨基苯乙醇的報(bào)道比較少見(jiàn)，國(guó)內(nèi)在2001年曾有過(guò)相關(guān)研究報(bào)道[9]，但其底物濃度僅有1g/L.

鑒于手性α-氨基醇在不對(duì)稱藥物合成中的重要作用，我們?cè)跇?gòu)建羰基還原酶制劑庫(kù)的過(guò)程中，開(kāi)展了以α-氨基苯乙酮為底物進(jìn)行微生物羰基還原酶篩選的工作，獲得了2株能將α-氨基苯乙酮還原成相應(yīng)手性醇的微生物，進(jìn)而進(jìn)行轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，以期為后續(xù)的分子生物學(xué)研究和酶分子的結(jié)構(gòu)改造奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集 土壤樣品取自天津楊柳青果園和江蘇前成生物有限公司廠區(qū).采集土樣裝入無(wú)菌袋中置于4 ℃保存，用于目標(biāo)菌的分離純化.

1.1.2 儀器與試劑 隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒，GHP-9270）；恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城，ZHWY-200D）；超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰，SW-CJ-1FD）；1260型高效液相色譜儀（HPLC）為Agilent Technologies，手性分離柱Crownpak CR[+]和OD-H均為DAICEL公司產(chǎn)品.蛋白胨、酵母粉為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，消旋α-氨基苯乙醇為T(mén)CI公司產(chǎn)品，α-氨基苯乙酮、苯乙酮、α-氯代苯乙酮、α-溴代苯乙酮、α-羥基苯乙酮、S型氨基苯乙醇和S型羥基苯乙醇為Alfa公司產(chǎn)品，其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，HPLC所用流動(dòng)相為色譜純.

1.2 方 法

1.2.1 目標(biāo)菌的富集和分離 將5 g土壤放入含有50 mL無(wú)菌水的250 mL搖瓶中，加入玻璃珠，250 r/min條件下?lián)u床振蕩2 h，靜置至土壤顆粒沉淀后取2 mL上清接種于含100 mL營(yíng)養(yǎng)鹽培養(yǎng)基1的500 mL搖瓶中.于30 ℃培養(yǎng)至菌液渾濁后（約2 d），加入甘油至終濃度15％保存，用于以后的實(shí)驗(yàn).將富集的菌液取200 μL加入含20 mL營(yíng)養(yǎng)鹽培養(yǎng)基2的100 mL三角瓶中，同時(shí)加入α-氨基苯乙酮鹽酸鹽至終濃度為3 g/L，在30℃、200 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)至菌液渾濁（約3 d），再取200 μL加入含20 mL營(yíng)養(yǎng)鹽培養(yǎng)基3的100 mL三角瓶中，同時(shí)加入α-氨基苯乙酮鹽酸鹽至終濃度為5 g/L，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，取菌液100 μL采用稀釋涂平板法進(jìn)行菌種分離（10-1～10-7倍稀釋涂平板），培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)3～6 d，挑取不同形態(tài)菌落在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基平板劃線培養(yǎng)至得到單菌落.純化的菌落接種于實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基斜面保存.

1.2.2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取及分析 分離得到的菌株從斜面挑取少量接種至20 mL實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中，30 ℃、200r/min條件下培養(yǎng)至菌液渾濁，再加入終濃度為3 g/L的α-氨基苯乙酮鹽酸鹽作為底物，隔12 h取樣分析轉(zhuǎn)化情況，取樣量為800 μL.用飽和碳酸鈉溶液將樣品調(diào)至堿性（pH = 10），再加入等體積乙酸乙酯，渦旋儀混勻后于12000 r/min離心1min.取上層有機(jī)相用薄層色譜層析（TLC）進(jìn)行初步檢測(cè).展開(kāi)劑為乙酸乙酯 ：異丙醇 ：氨水= 1：1：0.1，在254 nm的紫外燈下觀察.吹干展開(kāi)劑，將層析板置于1％茚三酮乙醇溶液中數(shù)秒后，使其受熱至有樣品顯色（底物顯黃色，Rf= 0.7；產(chǎn)物顯粉紫色，Rf= 0.4）.有產(chǎn)物點(diǎn)出現(xiàn)的樣品取500 μL有機(jī)相，充分揮發(fā)，等體積HPLC流動(dòng)相（pH = 2.0的HClO4水溶液）溶解，選用Crownpak CR[+]手性柱檢測(cè)e.e.值[10]，pH = 2.0的HClO4水溶液為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm.根據(jù)e.e.值、轉(zhuǎn)化率和底物譜收集相應(yīng)菌種.

1.2.3 對(duì)不同α位取代苯乙酮底物的生物轉(zhuǎn)化 在1.2.2的研究結(jié)果基礎(chǔ)上，將10株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物e.e.值高的菌株接種于5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的20 mL搖瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h后，分別加入α位取代苯乙酮：α-氯代苯乙酮、α-溴代苯乙酮、α-羥基苯乙酮以及苯乙酮.底物濃度為1g/L，在30℃、200 r/min條件下振蕩反應(yīng).轉(zhuǎn)化48 h后等體積乙酸乙酯全部萃取，分出有機(jī)相，充分揮發(fā)后加入1mL HPLC流動(dòng)相（異丙醇 ：正己烷= 10 ：90）溶解，選用OD-H手性柱檢測(cè)e.e.值，流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm.

1.2.4 形態(tài)初步觀察及分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)1.2.2和1.2.3的研究結(jié)果，對(duì)篩選出的菌株在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基固體平板上30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～8 d，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步觀察.分子生物學(xué)鑒定采用ITS-5.8S rDNA[11]序列分析方法.目標(biāo)菌與石英砂混合后液氮研磨，根據(jù)Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取.以ITS1和ITS4為引物[12]，對(duì)菌株的ITS-5.8S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用TIANGEN試劑盒回收，與pGEM-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化.驗(yàn)證載體已成功連接到目的片段后由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成測(cè)序.獲得序列信息應(yīng)用Blast程序與GenBank核算數(shù)據(jù)庫(kù)中序列比對(duì).

1.2.5 篩選菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將菌種接種于20 mL實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中30 ℃、200 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h后，作為種子液接種于20 mL實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)（接種比例為1％）繼續(xù)培養(yǎng)，前18 h每隔2 h取樣，18 h后每隔3 h取樣，每個(gè)取樣點(diǎn)為3個(gè)平行樣.收集培養(yǎng)菌體并烘干至恒重記錄菌體干重，以培養(yǎng)時(shí)間和菌重作圖[13～14]，獲得生長(zhǎng)曲線.

1.2.6 菌體轉(zhuǎn)化底物條件優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)菌種按1％接種比例，接種于適量體積的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h后（穩(wěn)定期），離心收集菌體，并用50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH = 7.0）洗滌兩次.分別設(shè)定5 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7）反應(yīng)體系：15 g/L 葡萄糖，3 g/L底物濃度，菌體濃度（干重，dry weight，DW）分別取20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L和100 g/L，在反應(yīng)6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h和48 h時(shí)分別取樣.不同底物濃度和反應(yīng)時(shí)間設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，30 ℃、200 r/min條件下?lián)u床振蕩反應(yīng)，在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)停止試驗(yàn)，并按1.2.2所述樣品處理進(jìn)行TLC檢測(cè)底物轉(zhuǎn)化.為優(yōu)化[15]最佳的底物轉(zhuǎn)化濃度，分別取1g/L、2 g/L 、3 g/L、4 g/L 、5 g/L 、8 g/L 和10 g/L的底物濃度進(jìn)行試驗(yàn).反應(yīng)條件為30℃、200 r/min搖床振蕩反應(yīng)，采用同1.2.2的TLC方法檢測(cè)底物轉(zhuǎn)化.

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)菌株的篩選和分離

通過(guò)富集分離，從土樣中獲得52株純化菌株，TLC檢測(cè)48株有活性.剔除形態(tài)相似菌株，對(duì)剩余19株菌的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如表1，菌株4802、2305和1201的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為S型，其中菌株4802的e.e.值最高，為70％，因此選定菌株4802用于進(jìn)一步研究.測(cè)試的其他菌株的產(chǎn)物構(gòu)型主要為R型，選取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物e.e.值較高（不低于99％）的9株菌（菌株編號(hào)分別為0401、0706、0101、1002、1004、1403、1503、1708、和2904）用于進(jìn)一步研究.用所選定的10株菌對(duì)不同α-取代苯乙酮底物進(jìn)行生物催化研究，只有菌種編號(hào)為4802和1403的兩株菌能轉(zhuǎn)化所測(cè)試的全部底物（表2）.因此選定菌株編號(hào)為4802和1403的2株菌種作為研究菌株.

表1 19株菌轉(zhuǎn)化α-氨基苯乙酮的產(chǎn)物e.e.值及轉(zhuǎn)化時(shí)間Table 1 Products’e.e.value and conversion time of all 19 strains

表2 e.e.值較高的10株菌對(duì)不同α-取代苯乙酮轉(zhuǎn)化的結(jié)果Table 2 Conversion of different α-substituted acetophenone by the selected strains with higher e.e.

菌株4802和1403均可以催化以α-氯代苯乙酮、α-溴代苯乙酮、α-羥基苯乙酮和苯乙酮為底物的還原反應(yīng)，且對(duì)α-羥基苯乙酮的立體選擇性很高.在實(shí)驗(yàn)中所用的相應(yīng)手性分離柱及分離條件下，消旋體都能得到很好的分離，R型先出峰，S型后出峰.菌株4802催化還原α-氨基苯乙酮和α-羥基苯乙酮的產(chǎn)物均為S構(gòu)型；然而有趣的是，菌株1403催化還原α-氨基苯乙酮產(chǎn)物為S構(gòu)型，而催化α-羥基苯乙酮的的產(chǎn)物為R構(gòu)型，在底物與酶蛋白質(zhì)作用的關(guān)系中，往往氨基和羥基的空間大小及電子效應(yīng)會(huì)比較類似，均可和氨基酸殘基發(fā)生氫鍵作用，一般得到的產(chǎn)物構(gòu)型應(yīng)該一致，而菌株1403卻表現(xiàn)出了不同構(gòu)型的催化活性，這一現(xiàn)象值得通過(guò)分子操作及蛋白晶體分析進(jìn)行更加深入的研究.HPLC分析圖譜分別見(jiàn)圖1和圖2.1、2為4802菌落的正反面，3、4為1403菌落正反面 1, 2 for face and back of strain 4802；3, 4 for face and back of strain

圖1 菌株4802和1403轉(zhuǎn)化α-羥基苯乙酮的產(chǎn)物HPLC譜圖Fig.1 HPLC spectrum of products of α-hydroxyacetophenone converted by strains 4802 and 1403

圖2 菌株4802和1403轉(zhuǎn)化α-氨基苯乙酮的產(chǎn)物HPLC譜圖Fig.2 HPLC spectrum of products of α-aminoacetophenone converted by strains 4802 and 1403

圖3 菌種4802和1403的菌落形態(tài)Fig.3 The morphology of strains 4802 and 1403

2.2 菌株鑒定

初步形態(tài)觀察（圖3）判斷兩株菌為真菌.菌株4802的菌落為圓形，正面為白色，反面為黃色，有同心環(huán)狀，邊緣整齊向四周呈放射狀擴(kuò)散，菌絲質(zhì)地厚密且平鋪于表面.培養(yǎng)48 h后，菌落直徑約為1.5 cm，72 h后菌落直徑約為2 cm，144 h后直徑約為4 cm.菌株1403的菌落為圓形，正面圓心處發(fā)淺黃色，離中心位置半徑2 mm有紫色的圓，與菌絲邊緣呈同心環(huán)狀，邊緣整齊向四周擴(kuò)散.菌絲在半徑7 mm以內(nèi)，緊密厚實(shí)，7 mm以外菌絲疏松.培養(yǎng)48 h，菌落直徑約為2 cm.

將測(cè)得的ITS-5.8S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST.結(jié)果顯示，菌株4802與Galactomyces geotrium多株菌序列相似性為99％，菌株1403與Fusarium oxysporum多株菌相似性達(dá)100％，從而確定這兩株菌分別屬于地霉屬和鐮刀菌屬.

2.3 篩選菌的生長(zhǎng)特性

4802和1403菌株在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基生長(zhǎng)為典型的絲狀真菌生長(zhǎng)曲線（圖4）.分為停滯期、迅速生長(zhǎng)期及衰退期.在24 h，兩株菌都到了穩(wěn)定期.

圖4 菌株1403和4802生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of strains 1403 and 4802

2.4 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

2.4.1 菌體濃度 反應(yīng)以α-氨基苯乙酮作為底物（終濃度為3 g/L）、反應(yīng)體系中含有15 g/L葡萄糖，5 mL磷酸鈉緩沖液（pH 7.0，50 mmol/L），以及不同量的菌體，用TLC定性檢測(cè)底物的消耗和產(chǎn)物的生成.菌株4802在不同菌體濃度下，轉(zhuǎn)化6 h后，都能檢測(cè)到有產(chǎn)物；轉(zhuǎn)化24 h后檢測(cè)結(jié)果顯示，菌體濃度為80 g/L（DW）時(shí)，產(chǎn)物含量較高（圖5-1）.菌株1403在不同菌體濃度下，轉(zhuǎn)化24 h后檢測(cè)結(jié)果顯示，菌體濃度為20 g/L（DW）時(shí)，產(chǎn)物含量較高，當(dāng)菌體濃度高于20 g/L反而產(chǎn)物含量明顯偏低（圖5-2）.具體原因有待進(jìn)一步的研究.

圖5 菌株4802和1403在不同菌體濃度（g/L，DW）下轉(zhuǎn)化反應(yīng)的TLC圖Fig.5 TLC of all products converted by different biomass concentration （g/L, DW）of strains 4802 and 1403

2.4.2 底物濃度 當(dāng)菌株4802和1403的菌體濃度分別為80 g/L和20 g/L時(shí)，在其他條件不變的情況下，加入不同底物濃度進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖6所示.菌株4802和1403的最高可以承受的底物濃度分別為3 g/L（圖6-1和圖6-2）和5 g/L（圖6-3和圖6-4），表現(xiàn)出了較好的底物耐受性.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察到隨著底物濃度的增加，產(chǎn)物量降低.可能原因?yàn)椋?）一定濃度的菌體內(nèi)催化底物還原的酶量是一定的，當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，產(chǎn)物的合成量隨底物濃度的提高而增加，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值時(shí)，菌體的催化能力達(dá)到飽和，此外也可能存在酶的底物抑制作用；2）隨著底物濃度升高，轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的靜息

圖6 菌株4802和1403在不同底物濃度（g/L）下轉(zhuǎn)化反應(yīng)的TLC圖Fig.6 TLC of all products converted by strains 4802 and 1403 using different substrate concentration （g/L）

3 結(jié) 論

考慮到α-氨基苯乙酮對(duì)菌體有一定毒性，本文采用逐步降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度、增加底物濃度的方法，使菌體逐步適應(yīng)底物，最終以α-氨基苯乙酮為唯一碳源獲得純化菌株，并結(jié)合轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的立體構(gòu)型選定了目標(biāo)菌株.

篩選得到了兩株可催化α-氨基苯乙酮不對(duì)稱還原分別生成R型和S型醇的微生物菌株.菌株4802為地霉屬，催化還原α-氨基苯乙酮得到S構(gòu)型的α-氨基苯乙醇，e.e.值為70％；最適生長(zhǎng)時(shí)間為24 h，在80 g/L的菌體濃度下，可以耐受達(dá)3 g/L底物濃度.菌株1403為鐮刀菌屬，催化還原α-氨基苯乙酮得到R構(gòu)型的α-氨基苯乙醇，e.e.值大于99％；最適生長(zhǎng)時(shí)間為24 h，在20 g/L的菌體濃度下，可以耐受達(dá)5 g/L底物濃度，并且當(dāng)以α-羥基苯乙酮底物時(shí)，菌株1403可以催化得到S構(gòu)型的α-羥基苯乙醇，e.e.值可達(dá)99％.

本研究獲得的菌種可為進(jìn)一步克隆獲得α-氨基苯乙酮羰基還原酶基因及對(duì)其進(jìn)行分子操作提高該酶的產(chǎn)物立體選擇性并研究其構(gòu)效關(guān)系打下基礎(chǔ)，相關(guān)基因克隆工作正在進(jìn)行中.

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