他克莫司膠囊含量與溶出方法學(xué)研究

劉 樺，孫為玉(1.北京市隆福醫(yī)院藥劑科，北京 100010;.北京嘉事聯(lián)博醫(yī)藥科技有限公司，北京100073)

他克莫司(acrolimus，F(xiàn)K506)，是從鏈霉菌屬(streptomyces tsukubaensis)中分離出的發(fā)酵產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬23元大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物。他克莫司為一種強(qiáng)力的新型免疫抑制劑，本品對T細(xì)胞具有選擇性的抑制作用，主要是通過抑制Th細(xì)胞釋放IL-2、IL-3，IFN-γ，以及抑制IL-2R的表達(dá)而發(fā)揮其強(qiáng)大的免疫抑制作用［1］，適用于防治器官移植后的排斥反應(yīng)，其臨床療效是CsA的100倍，上市劑型有膠囊劑、注射液等。近年來，他克莫司作為肝、腎移植的一線用藥，已在日本、美國等14個國家上市。臨床實(shí)驗(yàn)表明，其在心、肺、腸、骨髓等移植中應(yīng)用有很好的療效。同時他克莫司在治療特應(yīng)性皮炎(AD)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性眼病等自身免疫性疾病中也發(fā)揮著積極的作用。日本藤澤制藥公司生產(chǎn)的他克莫司膠囊及注射液分別于2001年和2002年進(jìn)入我國，目前《中華人民共和國藥典》還沒有收錄其檢測方法。他克莫司因?yàn)槠渲委煷罢R床應(yīng)用過程中必須監(jiān)測其血藥濃度。國內(nèi)外文獻(xiàn)上報(bào)道的含量測定方法主要是高效液相色譜法(HPLC)、反相離心色譜法(CCC)［2］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HPLC系統(tǒng):島津LC-20ATvp泵;島津SPD-10Avp紫外檢測器;島津CTO-10A柱溫箱;LC-Soultion工作站。

1.2 試藥

乙腈(色譜純，Sigma);他克莫司原料、他克莫司對照品、異構(gòu)體、雜質(zhì)(某國內(nèi)制藥企業(yè)提供)，他克莫司膠囊［安斯泰來制藥(中國)有限公司，批號:1D5222A、0D5594A、1D5716A］。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC條件

色譜柱:迪馬C8(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相:乙腈-水(75∶25)，流速:1.0 mL·min－1，波長:210 nm，柱溫50℃，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 線性與范圍

精密稱定他克莫司對照品適量置容量瓶中，以無水乙醇稀釋，制成他克莫司對照品溶液，濃度分別約為7.5、10.0、12.5、15.0、50.0、75.0、100.0、125.0 μg·mL－1，依“2.1”項(xiàng)所述色譜條件，分別取對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積(A)和濃度(C，μg·mL－1)作線性回歸，得出線性方程式為:Y=12 254 969.460 5X－11 833.369 0(Y為峰面積，X為濃度)，r=0.999 5，見表1。

表1 他克莫司含量、溶出度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab 1 Standard curves of the dissolution and content determination of Tacrolimus

2.3 重復(fù)性

精密稱定他克莫司膠囊內(nèi)容物適量，以無水乙醇稀釋，制成他克莫司樣品溶液，濃度約為100.0 μg·mL－1(含量測定)、10.0 μg·mL－1(溶出度測定)，離心，靜置，在“2.1”項(xiàng)所述色譜條件下，取2種樣品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)6次，以峰面積計(jì)算RSD值，分別為0.78%、1.08%。

2.4 重現(xiàn)性

2.4.1 他克莫司膠囊含量重現(xiàn)性測定:精密稱定他克莫司膠囊內(nèi)容物適量，以無水乙醇稀釋，制成他克莫司樣品溶液，濃度約為100.0 μg·mL－1，平行6份;另精密稱定他克莫司對照品適量，以無水乙醇稀釋，制成他克莫司對照品溶液，濃度約為100.0 μg·mL－1，離心，靜置，在“2.1”項(xiàng)所述色譜條件下，精密量取供試品和對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算，以含量計(jì)算RSD值，為0.86%，見圖1。

2.4.2 他克莫司膠囊溶出度重現(xiàn)性測定:精密稱定克莫司膠囊內(nèi)容物適量，以無水乙醇稀釋，制成他克莫司樣品溶液，濃度約為10.0 μg·mL－1，平行6份，作為供試品溶液;另精密稱定他克莫司對照品適量，以無水乙醇稀釋，制成每他克莫司對照品溶液，濃度約為10.0 μg·mL－1，離心，靜置，在“2.1”項(xiàng)所述色譜條件下，精密量取供試品和對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算，以含量計(jì)算RSD值，為1.08%，見圖2。

2.5 回收率

2.5.1 他克莫司膠囊含量回收率測定:取“2.4”項(xiàng)下他克莫司對照品100 μg·mL－1溶液，分別精密量取5 mL，共9份，均分為3組，置10 mL容量瓶中，精密稱定加入他克莫司對照品分別約8、10、12 mg，振搖使之溶解，以無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，按照“2.4”項(xiàng)下方法操作并測定，計(jì)算低、中、高3種加入量的加樣回收率，見表2。

表2 他克莫司膠囊含量回收率測定結(jié)果Tab 2 Recovery rate of tacrolimus

2.5.2 他克莫司溶出度回收率測定:取“2.4”項(xiàng)下他克莫司對照品10 μg·mL－1溶液，分別精密量取5 mL，共9份，平均分為3組，置10 mL容量瓶中，精密稱定加入他克莫司對照品分別約8、10、12 mg，振搖使之溶解，以無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，按照“2.4”項(xiàng)下方法操作并測定，計(jì)算低、中、高3種加入量的加樣回收率，見表3。

圖2 他克莫司膠囊溶出度高效液相色譜圖Fig 2 HPLC of dissolution rate of tacrolimus capsulesD.空白輔料;E.對照;F.樣品D:blank excipients;E:control;F:sample

表3 他克莫司溶出度回收率測定結(jié)果Tab 3 Dissolution rate of tacrolimus

2.6 樣品含量測定

依照《中華人民共和國藥典》的方法，精密稱定膠囊內(nèi)容物適量，以無水乙醇溶解并稀釋制成他克莫司樣品溶液，濃度約為100.0 μg·mL－1;另精密稱定他克莫司對照品適量，以無水乙醇稀釋制成含他克莫司對照品溶液，濃度約為100.0 μg· mL－1，離心，靜置，在“2.1”項(xiàng)所述色譜條件下，精密量取供試品和對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算含量。對市售3批他克莫司膠囊進(jìn)行了含量測定，結(jié)果批號為 1D5222A、0D5594A、1D5716A的含量分別為99.28%、99.86%、99.75%。

2.7 樣品溶出曲線

取他克莫司膠囊，照溶出度測定法［《中華人民共和國藥典:二部》(2010年版)附錄XC第二法］，以水為溶劑，轉(zhuǎn)速為100 r·min－1，分別于10、20、30、45、60、70 min時取溶液2 mL并補(bǔ)充同體積的溶出介質(zhì)，將取出的溶液置離心機(jī)離心10 min，轉(zhuǎn)速為3 000 r·min－1，靜置6 h，精密量取20 μL溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另精密稱定他克莫司對照品適量，以乙醇稀釋制成他克莫司對照品溶液，濃度約為10 μg·mL－1，靜置6 h精密量取20 μL溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算的溶出量，作溶出曲線，見表4。

表4 他克莫司膠囊溶出曲線測定結(jié)果Tab 4 Dissolution curves of tacrolimus capsules

2.8 溶出介質(zhì)的比較

照溶出度測定法，取他克莫司膠囊，以水、0.1 mol·L－1HCl、pH為6.8的緩沖溶液為溶出介質(zhì)分別進(jìn)行考察，轉(zhuǎn)速均為100 r·min－1，于溶出研究45 min時取樣，將取出的溶液置離心機(jī)離心10 min，轉(zhuǎn)速為3 000 r·min－1，溶液分別于靜置0、2、4、6、8、10 h連續(xù)進(jìn)針6次，進(jìn)樣量20 μL，以峰面積計(jì)算RSD值，比較不同溶出介質(zhì)在平衡不同時間的重復(fù)性，見表5。

表5 他克莫司膠囊溶出介質(zhì)比較Tab 5 Reproducibility of different dissolution media at different equilibrium time

3 討論

有相關(guān)研究文獻(xiàn)報(bào)道［3-5］，而在有機(jī)溶劑(非極性)中，他克莫司的各異構(gòu)體能保持穩(wěn)定，在水溶劑中或含水的有機(jī)溶液中他克莫司較易發(fā)生異構(gòu)互變，異構(gòu)互變達(dá)到平衡需要一定時間，且達(dá)到平衡的時間跟溶劑的構(gòu)成中含水量的多少有一定關(guān)系，在含水的乙腈、乙醇等溶劑中都存在此問題，直接導(dǎo)致HPLC法測定中峰面積和峰高的差異，從而影響定量測定精確度;而在不含水的有機(jī)溶劑中未見互變異構(gòu)體形成。本研究以無水乙醇為溶劑的試驗(yàn)表明，峰面積可持續(xù)穩(wěn)定，結(jié)果提示，在無水乙醇溶劑中，他克莫司未發(fā)生互變異構(gòu)，故選擇無水乙醇作為本品的含量測定溶劑。

經(jīng)PDA檢測器掃描分析研究，發(fā)現(xiàn)他克莫司2個異構(gòu)體及主要雜質(zhì)(由國內(nèi)制藥企業(yè)提供)均在210～220 nm區(qū)間末端吸收較為明顯，經(jīng)綜合考慮，選擇210 nm作為檢測波長。由于他克莫司膠囊樣品濃度較低，紫外響應(yīng)值相應(yīng)較低，故本研究采用加樣回收率檢測，且在溶出度取樣后未采取過濾處理，原因?yàn)樵囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)過濾過程產(chǎn)生吸附，影響測定結(jié)果，故本研究采用離心取上清液的方法。

文獻(xiàn)報(bào)道［4，6］溶出介質(zhì)中，靜置6 h后5 h內(nèi)他克莫司主峰面積較穩(wěn)定，乙腈-水(1∶1)體系中，溶液平衡時間為3 h。本文對他克莫司含水溶出介質(zhì)分別進(jìn)行了考察，當(dāng)水為溶出介質(zhì)時，在靜置開始的前4 h其RSD值十分不穩(wěn)定，測定結(jié)果成倍增長，6～10 h則變化不大;當(dāng)0.1 mol·L－1HCl為溶出介質(zhì)時，RSD值一直較不穩(wěn)定，波動較大;當(dāng)采用pH為6.8的緩沖溶液為溶出介質(zhì)時，在靜置的前6 h其RSD值不穩(wěn)定，8～12 h內(nèi)則變化不大且較為穩(wěn)定。根據(jù)溶出介質(zhì)考察結(jié)果，考慮試驗(yàn)時間，本文溶出度研究以水為溶出介質(zhì)，靜置時間確定為6 h。

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