內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體 (ESCRT) 及其在包膜病毒出芽中的作用

李朝飛，田宏剛，劉同先

西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100

在細(xì)胞正常的生理代謝過(guò)程中，膜蛋白需要選擇性地通過(guò)內(nèi)吞體途徑被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體降解。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體(Endosomal sorting complex required for transport，ESCRT) 負(fù)責(zé)識(shí)別內(nèi)吞體途徑中泛素化修飾的膜蛋白，包括錯(cuò)誤折疊的蛋白、激活的生長(zhǎng)與細(xì)胞因子受體等，并介導(dǎo)內(nèi)吞小泡 (Intralumenal vesicles) 出芽和多泡體 (Multivesicular bodies，MVBs) 的形成[1]。除了參與膜蛋白的分選與轉(zhuǎn)運(yùn)，ESCRT也參與胞質(zhì)分裂、自體吞噬、以及包膜病毒的出芽等過(guò)程[2-4]。ESCRT復(fù)合體對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、抑制腫瘤和神經(jīng)退行性疾病、以及限制病原物的入侵等具有十分重要的作用[4]。

1 ESCRT復(fù)合體的組成

迄今的研究表明，ESCRT復(fù)合體保守地存在于真核生物中。哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ESCRT系統(tǒng)由ESCRT-0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、和VPS4 (Vacuolar protein sorting-associated protein 4) 等5個(gè)復(fù)合物以及包括 Alix (ALG-2 (Apoptosis-linked gene 2)-interacting protein X) 等在內(nèi)的一些輔助蛋白組成[2-3](圖1)。

圖1 宿主細(xì)胞ESCRT復(fù)合體及其與包膜病毒編碼的晚期結(jié)構(gòu)域之間的相互作用Fig. 1 Host cellular ESCRT complex and the interaction of the complex with the late-domain motifs encoded by enveloped viruses. Ubi: ubiquitin.

1.1 ESCRT-0

ESCRT-0是一個(gè)異源雙聚體，由 HRS (Hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate) 與 STAM (Signal transducing adaptor molecule) 兩個(gè)蛋白組成。該復(fù)合物參與細(xì)胞內(nèi)吞途徑中泛素化蛋白的分選 (Sorting)。研究發(fā)現(xiàn)，ESCRT-0通過(guò)其亞基HRS的FYVE模序結(jié)合內(nèi)吞體膜上的PI(3)P磷脂，并通過(guò)其亞基HRS與STAM C-末端的clathrin-box模序與籠形蛋白 (Clathrin) 結(jié)合，將籠形蛋白募集?；\形蛋白的聚合為蛋白質(zhì)分選提供了一個(gè)平臺(tái)。在這個(gè)分選區(qū)域，ESCRT-0通過(guò)其兩個(gè)亞基含有的泛素作用模序 (Ubiquitin-interacting motif) 與泛素結(jié)合，從而對(duì)泛素化修飾的膜蛋白進(jìn)行識(shí)別和分選[1-3]。

1.2 ESCRT-Ⅰ與ESCRT-Ⅱ

ESCRT-Ⅰ與ESCRT-Ⅱ均為異源四聚體，其中ESCRT-Ⅰ由VPS23、VPS28、VPS37以及多泡體因子12 (MVB12) 組成，而ESCRT-Ⅱ則由VPS22、VPS36和2個(gè)VPS25分子組成。ESCRT-Ⅰ亞基VPS23能與ESCRT-0亞基HRS的PSAP模序結(jié)合，VPS37則與脂質(zhì)膜之間能形成靜電相互作用，MVB12能與Alix相互作用，而 VPS28則通過(guò)其 C-末端的螺旋結(jié)構(gòu)域與ESCRT-Ⅱ結(jié)合。ESCRT-Ⅱ呈Y型結(jié)構(gòu)，VPS22與 VPS36相互作用形成 Y型的柄部，而 2個(gè)VPS25分子則處于 Y型結(jié)構(gòu)伸展的頂端。VPS25 C-末端的螺旋結(jié)構(gòu)具有結(jié)合和激活ESCRT-Ⅲ的功能。ESCRT-Ⅰ與ESCRT-Ⅱ均參與內(nèi)吞小泡的出芽 (Budding)[1-3]，但詳細(xì)的分子機(jī)理仍不清楚。

1.3 ESCRT-Ⅲ

ESCRT-Ⅲ是一個(gè)動(dòng)態(tài)多聚體，其組分仍沒(méi)有明確的定義。目前的研究表明，哺乳動(dòng)物細(xì)胞ESCRT-Ⅲ至少由12個(gè)極性多泡體蛋白 (Charged multivesicular body proteins，CHMPs) 組成，其中包括CHMP2、CHMP3、CHMP4和CHMP6。組成 ESCRT-Ⅲ的這些蛋白具有類(lèi)似的分子結(jié)構(gòu)并依賴(lài)于分子內(nèi)自抑制機(jī)制以無(wú)活性的單體形式存在。激活的 ESCRT-Ⅲ組分能形成具有高度調(diào)節(jié)性的多聚體。ESCRT-Ⅲ參與“出芽”小泡從內(nèi)吞體膜上的解離 (Scission)[1-3]。研究表明，ESCRT-Ⅲ亞基之間相互作用形成螺旋絲狀結(jié)構(gòu)，而各個(gè)亞基開(kāi)放的堿性功能區(qū)與“出芽”小泡頸部酸性的膜磷脂之間形成靜電相互作用。隨著ESCRT-Ⅲ螺旋結(jié)構(gòu)的不斷增長(zhǎng)，小泡頸部的內(nèi)吞體膜不斷凹陷縊縮，直至小泡從內(nèi)吞體膜上解離脫落[3,5]。

1.4 VPS4及其復(fù)合物

VPS4是ESCRT復(fù)合體活性的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，屬于 AAA (ATPase associated with various cellular activities) 類(lèi)ATP酶家族，高度保守地存在于真核生物中[2,6]。VPS4由約430個(gè)氨基酸組成，由N-末端參與底物結(jié)合的MIT (Microtubule interacting and transport) 結(jié)構(gòu)域，中間的AAA結(jié)構(gòu)域 (Type-1 AAA ATPase)，以及C-端結(jié)合LIP5 (LYST-interacting protein 5) 的 β-折疊結(jié)構(gòu)域和C-末端參與 VPS4二聚體形成的 α-螺旋組成。VPS4在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以無(wú)活性的單體形式存在，激活的VPS4可能由12個(gè)單體多聚化形成2個(gè)六聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)。最近的研究表明，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的VPS46與Ist1 (Increased sodium tolerance protein 1) 蛋白與VPS4單體結(jié)合形成復(fù)合體，該復(fù)合體通過(guò)VPS4蛋白N-末端的MIT進(jìn)一步與ESCRT-Ⅲ復(fù)合體的CHMP2、CHMP3、CHMP4以及CHMP6各亞基 C-末端的 MIMs模序 (MIT-interacting motifs) 結(jié)合。而后，該復(fù)合物募集細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Vta1 (VPS20(CHMP6)-associated protein 1) 蛋白。Vta1可能起始促進(jìn)VPS4多聚體的形成及其ATP酶的激活，促使 ESCRT-Ⅲ解聚[7-9]。采用RNA干擾或表達(dá)顯性-負(fù)性 (Dominant-negative)突變體失活細(xì)胞內(nèi)源性VPS4，將造成ESCRT系統(tǒng)的累積，并在酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)形成內(nèi)吞體異常的表型[7,10-11]。

2 ESCRT復(fù)合體在包膜病毒出芽中的作用

病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)完成復(fù)制后需要組裝和釋放。研究表明多數(shù)包膜病毒的出芽釋放依賴(lài)于宿主細(xì)胞ESCRT復(fù)合體的功能[12]。

2.1 ESCRT復(fù)合體在哺乳動(dòng)物包膜病毒出芽中的作用

目前，已有的病毒出芽釋放分子機(jī)理主要來(lái)源于對(duì)反轉(zhuǎn)錄病毒的研究[13]。研究發(fā)現(xiàn)，反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)蛋白 Gag含有“晚期結(jié)構(gòu)域”(Late-domains)，其核心序列為P(S/T)AP、PPXY、或YPXnL (n≤3)。Gag晚期結(jié)構(gòu)域P(S/T)AP能結(jié)合ESCRT-Ⅰ亞基VPS23，YPXnL能結(jié)合Alix，而PPXY則能結(jié)合E3泛素連接酶Nedd4 (Neural precursor cell expressed developmental downregulated gene 4)[13-15](圖1)。通過(guò)與ESCRT亞基相互作用，Gag將ESCRT-Ⅰ和Alix等募集在病毒組裝與出芽的細(xì)胞膜區(qū)域，并通過(guò) ESCRT-Ⅰ或Alix蛋白進(jìn)一步募集ESCRT-Ⅲ與VPS4[13]。研究表明，Gag自身能起始病毒的組裝和出芽(Assembly and budding)，卻需要 ESCRT-Ⅲ和VPS4將病毒粒子從細(xì)胞膜上解離和釋放(Scission and release)[3]。迄今關(guān)于Gag泛素化修飾的意義，ESCRT-Ⅲ的激活機(jī)理，以及不同病毒對(duì)ESCRT組分依賴(lài)的差異性仍不清楚。

近期的研究發(fā)現(xiàn)，除了反轉(zhuǎn)錄病毒以外，大量的RNA病毒，如彈狀病毒 (Rhabdoviruses)、絲 狀 病 毒 (Filoviruses)和 副 粘 病 毒(Paramyxoviruses) 等均含有晚期結(jié)構(gòu)域。突變這些氨基酸序列能抑制病毒的出芽和釋放[12,16]。深入研究發(fā)現(xiàn)，這些病毒的出芽釋放也依賴(lài)于宿主細(xì)胞 ESCRT復(fù)合體[12,16]。此外，少量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一些DNA病毒，如乙肝病毒 (Hepatitis B) 和皰疹病毒 (Herpes simplex virus type-1) 的出芽也與宿主細(xì)胞的ESCRT系統(tǒng)有關(guān)。瞬時(shí)表達(dá)顯性-負(fù)性ESCRT-Ⅲ蛋白，如CHMP3和CHMP4等，或VPS4均能抑制病毒粒子出芽釋放[17-18]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，并非所有包膜病毒的出芽和釋放依賴(lài)于ESCRT。瞬時(shí)表達(dá)顯性-負(fù)性VPS4對(duì)流感病毒 (Influenza virus) 和呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus) 的出芽和釋放沒(méi)有影響，并且在這兩種RNA病毒中也不存在典型的晚期結(jié)構(gòu)域[12,19-20]。深入研究表明，流感病毒編碼的M2離子通道蛋白行使ESCRT功能在病毒出芽和釋放過(guò)程中起作用。這是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)ESCRT-非依賴(lài)的病毒出芽釋放機(jī)制[21]。

2.2 ESCRT復(fù)合體在昆蟲(chóng)桿狀病毒侵染中的作用

桿狀病毒是一類(lèi)在自然界中專(zhuān)一性寄生節(jié)肢動(dòng)物的雙鏈環(huán)狀DNA包膜病毒，其基因組大小約為80~180 kb。目前已發(fā)現(xiàn)的600多種桿狀病毒，絕大多數(shù)分離自被感染的鱗翅目、雙翅目和膜翅目昆蟲(chóng)[22]。桿狀病毒可作為安全的生物殺蟲(chóng)劑，外源基因表達(dá)與展示載體，以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體[23-25]。桿狀病毒在侵染過(guò)程中通常產(chǎn)生兩種形態(tài)的病毒粒子：包埋型病毒粒子(Occlusion-derived virions，ODV) 和芽生型病毒粒子 (Budded virions，BV)。ODV是昆蟲(chóng)個(gè)體間水平感染的病毒形式，病毒包膜由核內(nèi)膜獲得，其外包被有多角體蛋白晶體。在昆蟲(chóng)中腸堿性環(huán)境下，多角體晶體裂解釋放出ODV病毒粒子，起始感染昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞。BV是昆蟲(chóng)個(gè)體內(nèi)或離體條件下細(xì)胞間感染的病毒形式，病毒核衣殼從細(xì)胞膜出芽時(shí)獲得包膜[23]。

目前，廣泛深入研究的桿狀病毒為苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒 (Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)[23]。研究表明，AcMNPV芽生型病毒依賴(lài)其包膜表面的糖蛋白GP64識(shí)別可能的宿主細(xì)胞受體，并通過(guò)籠形蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞[23,26-27]。在內(nèi)吞體酸性條件下，GP64蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化并引發(fā)病毒包膜與內(nèi)吞體膜融合，進(jìn)而釋放出病毒核衣殼[28-29]。核衣殼依賴(lài)肌動(dòng)蛋白絲被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，起始病毒復(fù)制[23,30]。早期的電鏡觀(guān)察結(jié)果表明，桿狀病毒在宿主細(xì)胞核內(nèi)完成復(fù)制后，病毒核衣殼以類(lèi)似起泡 (Blebbing) 的方式從核膜出芽。核衣殼被包被在含有雙層核膜的小泡內(nèi)。隨后，該小泡在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)很快以未知的方式消失，裸露的病毒核衣殼可能依賴(lài)肌動(dòng)蛋白絲被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)膜出芽[30-32]。近年來(lái)，一些與小泡運(yùn)輸相關(guān)的宿主細(xì)胞蛋白被發(fā)現(xiàn)存在于AcMNPV 芽生型病毒粒子中[33]。但是關(guān)于AcMNPV病毒粒子的組裝、出芽和釋放仍然知之甚少。

最近的研究表明，與其他包膜病毒不同的是，表達(dá)草地貪夜蛾 Spodoptera frugiperda Sf9細(xì)胞 VPS4蛋白的顯性-負(fù)性突變體不僅能顯著抑制AcMNPV芽生型病毒粒子的出芽釋放，而且能影響AcMNPV的入侵 (Entry)。研究發(fā)現(xiàn)，熒光標(biāo)記的病毒粒子雖能有效結(jié)合并進(jìn)入表達(dá)VPS4顯性-負(fù)性突變體的宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞，但卻被阻斷在異常的內(nèi)吞體內(nèi)，核衣殼不能被釋放進(jìn)入細(xì)胞核復(fù)制。通過(guò)利用病毒基因組DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞表達(dá) VPS4顯性-負(fù)性突變體，可以避免VPS4突變體對(duì)病毒入侵的影響。研究發(fā)現(xiàn)，AcMNPV芽生型病毒粒子的產(chǎn)量急劇下降，揭示了宿主細(xì)胞ESCRT系統(tǒng)參與桿狀病毒的入侵與出芽釋放過(guò)程[11]。關(guān)于宿主ESCRT系統(tǒng)參與桿狀病毒侵染的分子機(jī)理仍在進(jìn)一步研究中。

3 展望

自從2001年Katzmann等[34]發(fā)現(xiàn)ESCRT復(fù)合體以來(lái)，關(guān)于ESCRT復(fù)合體結(jié)構(gòu)與功能的研究已成為生物學(xué)領(lǐng)域新的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)的研究，特別在ESCRT復(fù)合體的純化、分子遺傳鑒定、晶體與結(jié)構(gòu)解析以及功能重建等方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。現(xiàn)已基本清楚轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的識(shí)別機(jī)理和ESCRT-0、Ⅰ、Ⅱ等復(fù)合物的組分及其有序的募集過(guò)程。但是，關(guān)于 ESCRT-Ⅲ的組分及其如何形成一個(gè)有功能的動(dòng)態(tài)多聚體，又如何參與膜的變形、縊縮與解離等過(guò)程，尚不清楚。另外，關(guān)于 VPS4如何促使 ESCRT-Ⅲ解聚以維持ESCRT系統(tǒng)的循環(huán)利用，也有待于深入研究。

目前，ESCRT復(fù)合體與病毒侵染相關(guān)的研究主要集中在該復(fù)合體如何參與包膜病毒的出芽釋放方面，已有的病毒出芽理論也主要來(lái)自于對(duì)反轉(zhuǎn)錄病毒、特別是 HIV-1 (Human immunodeficiency virus，type 1) 的研究。關(guān)于ESCRT復(fù)合體參與其他病毒、特別是DNA包膜病毒侵染機(jī)理的研究相對(duì)較少。近年來(lái)，隨著基因組學(xué)的迅猛發(fā)展，病毒與其宿主細(xì)胞的遺傳背景越來(lái)越清楚。在此基礎(chǔ)上，深入開(kāi)展 ESCRT參與多種病毒侵染分子機(jī)理的研究，將為抗病毒研究提供新的思路和方法，有助于病毒性疾病的治療。同時(shí)，對(duì)一些人類(lèi)可利用的病毒 (如昆蟲(chóng)桿狀病毒) 開(kāi)展類(lèi)似的研究，也有利于促進(jìn)這類(lèi)病毒的遺傳改良和應(yīng)用。

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