甲型流感病毒蛋白和遺傳物質(zhì)在宿主細胞質(zhì)內(nèi)順向轉運過程及其機制

池曉娟，王松，黃一帆，陳吉龍

1 福建農(nóng)林大學動物科學學院動物醫(yī)學系, 福建 福州 350002

2 中國科學院微生物研究所 中國科學院病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101

甲型流感病毒由3個主要的亞病毒成分組成：1) 三種跨膜蛋白，包括血凝素 (Hemagglutinin，HA)、神經(jīng)氨酸酶 (Neuraminidase，NA) 和基質(zhì)蛋白2 (Matrix protein 2，M2)；2) 中間層基質(zhì)蛋白M1；3) 內(nèi)部螺旋形的核糖核蛋白 (vRNP)[1]。流感病毒利用宿主細胞的復制機制，完成自身組分的合成和轉運[2]。病毒首先通過囊膜上的 HA糖蛋白與宿主細胞表面的唾液酸受體相結合[3]，吸附于宿主細胞表面，再通過內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)。然后H+經(jīng)M2離子通道進入病毒粒子內(nèi)，使病毒內(nèi)部的 pH值由中性變?yōu)樗嵝浴４藭r，HA的構象發(fā)生改變，形成α螺旋，暴露融合肽，使病毒與宿主細胞相互融合，將病毒的內(nèi)部組分釋放出來[4]。vRNP和M1進入細胞核，開始病毒基因組的轉錄與復制過程。編碼病毒蛋白的mRNAs經(jīng)由 NXF1/TAP (Nuclear RNA export factor 1) 作用出核[5]。病毒的HA、NA和M2蛋白在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中翻譯，又經(jīng)高爾基體向細胞膜的病毒包裝位點處轉運。另一方面，病毒基因組RNA與核蛋白 (Nucleoprotein，NP) 形成vRNP復合物，經(jīng)CRM1介導出核，在這一過程中病毒蛋白M1、NP和非結構蛋白NS2發(fā)揮重要作用[6-10]。新合成的vRNPs以及其他病毒蛋白出核后也向特定的病毒包裝位點轉移，各組分之間發(fā)生有序的相互作用，開啟病毒粒子的包裝和出芽過程。病毒粒子的形態(tài)發(fā)生需要各組分準確的轉運到相應的包裝位點和正確的分類排序。在某種程度上，這一過程有賴于宿主細胞轉運機制的精確時空調(diào)控作用。以下將主要闡述新合成的流感病毒跨膜蛋白和基因組在宿主細胞質(zhì)內(nèi)的順向轉運過程及其機制，有助于我們更加深入地了解流感病毒的致病機制，為抗流感藥物的設計提供參考依據(jù)。

1 跨膜蛋白的轉運過程

流感病毒的HA、NA和M2這3個跨膜蛋白在宿主細胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體內(nèi)合成。然后，它們被轉運到高爾基體，并由高爾基體反面網(wǎng)絡狀結構 (TGN) 出高爾基體，再由各自的運輸小泡向細胞膜運輸[11]。流感病毒的跨膜蛋白根據(jù)頂端分選信號 (Apical sorting signals) 在細胞膜上有序地分類排列[12]，其中M2的分選信號仍不完全清楚。流感病毒的跨膜蛋白在宿主細胞質(zhì)內(nèi)順向轉運過程中經(jīng)過不斷的糖基化等修飾，HA和NA被折疊和糖基化后，HA組裝成三聚體，NA和M2則組裝成四聚體。

1.1 HA的轉運過程

HA是典型的I型糖蛋白，它是流感病毒最主要的表面糖蛋白，其三聚體的頭部含有3個受體結合位點。它與唾液酸受體的結合，是流感病毒吸附于宿主細胞的關鍵步驟。因此，HA是流感病毒不可缺失的部分，必須準時并且準確地轉運到包裝位點，進入子代病毒粒子。

HA在核糖體內(nèi)翻譯后，又在氨基末端信號的促進下，生成多肽鏈。隨后移入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，再進入高爾基體加工修飾。在這個過程中，HA發(fā)生一系列的共翻譯修飾和翻譯后修飾：在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，HA附加上N-糖苷側鏈碳水化合物；在高爾基體內(nèi)，重裝寡糖和通過蛋白水解酶作用將HA前體裂解成HA1和HA2。過表達高爾基體微管相關蛋白 210 (GMAP-210) 會阻礙HA從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的順向運輸[13]。最后，HA由TGN運輸?shù)郊毎け砻?，GTP結合蛋白參與該過程[14]。例如，小 G蛋白 Rab6會調(diào)控HA在TGN的轉運，表現(xiàn)為抑制其順向轉運或正向調(diào)節(jié)其逆向運輸[15]。

關于HA自身結構的研究顯示，位于HA跨膜區(qū) (TMD) 中間部分的氨基酸序列對HA向細胞膜轉運的頂端分選 (蛋白質(zhì)分選) 有重要作用，外質(zhì)部分對脂筏結合有重要作用。相關研究發(fā)現(xiàn)，損耗宿主細胞的膽固醇后，野生型HA進入脂筏的能力減弱，但在頂端和基底外側部的分類排列不受影響。研究發(fā)現(xiàn)，HA跨膜區(qū)的 520和521位氨基酸突變后，在脂筏存在時，HA突變體向細胞膜表面的轉運受抑制。而將宿主細胞膽固醇損耗后，該HA突變體則能隨意的轉運[16]。由此可見，HA進入脂筏是其頂端分選的必要條件，但非充分條件?？赡茉贖A頂端分選排列時，它的跨膜區(qū)還要結合其他蛋白或者脂類。另外，刪除HA的胞質(zhì)區(qū)尾部能減弱HA與脂筏的連接，但對其頂端轉運 (Apical transport) 無影響[17]。Brewer和Roth發(fā)現(xiàn)在MDCK細胞中，經(jīng)突變的HA (Cys543→Tyr543) 不會向細胞膜的頂端部位轉運，而是直接轉運至基底膜，但它在胞內(nèi)的運輸以及在細胞表面的表達均不受影響[18]。

HA出高爾基體的TGN后，經(jīng)胞吐通路向細胞膜上轉運。除小G蛋白Rab外，目前還不完全清楚其他宿主因子參與調(diào)控這一過程的情況。早期的研究顯示抗小窩蛋白1 (Caveolin-1) 抗體會抑制HA在MDCK細胞中的轉運[19]。然而，Manninen等在觀察敲除caveolin-1的MDCK細胞和正常MDCK細胞內(nèi)HA向細胞膜表面轉運時，發(fā)現(xiàn)兩者并無明顯差異。因此，他們認為，caveolin-1不是HA向細胞膜表面有效轉運所必需的宿主因子[20]。對于兩種研究得出的不同結果，Scheiffele等認為，可能是因為caveolin-1抗體與高分子量的caveolin-1寡聚物結合后，使頂端轉運出現(xiàn)空間障礙，導致HA的轉運受抑制。至于HA是否還受到其他宿主因子的調(diào)控了解甚少，有待進一步研究。

1.2 NA的轉運過程

流感病毒粒子出芽后，由于HA與宿主細胞表面的唾液酸相互作用，病毒粒子仍然附著在細胞膜上。所以，病毒粒子的有效釋放需要依賴于NA蛋白的活性。NA為糖苷外切酶，可以從α-糖苷鍵上去除唾液酸殘基，使病毒粒子脫離宿主細胞受體而釋放[21]。Calder等研究發(fā)現(xiàn)，NA聚集在出芽病毒粒子的某單一位點上[22]，反映了NA在病毒粒子從細胞表面釋放過程中起重要作用。另外，也有一些研究結果顯示NA參與流感病毒的形態(tài)發(fā)生及出芽過程[1,23-24]。由此可見，有效地將NA轉運到細胞膜表面是子代流感病毒顆粒的形態(tài)發(fā)生、出芽和成功地從感染細胞中釋放的重要前提條件。

NA是 II型跨膜糖蛋白。Kundu等通過對NA跨膜區(qū)的研究，首次證明了其跨膜區(qū)在蛋白質(zhì)分選和脂筏結合中的作用[25]。NA跨膜區(qū)中數(shù)個肽段含有蛋白極性運輸?shù)男盘?。Nayak實驗室研究發(fā)現(xiàn)，位于NA跨膜區(qū)的19個氨基酸(aa 9-27) 能夠充分介導NA向細胞膜運輸，跨膜區(qū)的序列對于NA與脂筏結合也有重要作用。雖然這些序列有重疊部分，但是它們作用不同，不會相互影響[26]。后來，Barman等對NA跨膜區(qū)進行深入研究，發(fā)現(xiàn) NA跨膜區(qū)的 aa11-13、aa23-26和aa32-35在NA向細胞膜極性運輸中起重要作用[27]。

關于NA在宿主細胞內(nèi)轉運過程中是否受到宿主因子調(diào)控的研究報道很少。最近，我們研究發(fā)現(xiàn)，分布于宿主細胞質(zhì)的小G蛋白Cdc42在有活性狀態(tài)下，能促進NA蛋白向細胞膜上運輸，而Cdc42特異的GTP酶激活蛋白ARHGAP21則會抑制該過程，從而影響流感病毒復制[28]。我們研究還發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染導致了 ARHGAP21表達水平的下調(diào)，從而使Cdc42活性升高，有利于NA蛋白向細胞膜上轉運[28]。

1.3 M2的轉運過程

M2除了具有離子通道功能，目前不少研究證實M2可與膽固醇結合[29-30]，但是當病毒的其他蛋白不表達時，M2則定位于細胞膜的無脂筏區(qū)域[31]。Chen等[32]和Rossman等[29]推測M1與M2結合會募集M2于富含脂筏的病毒出芽位點，然后結合膽固醇，使M2穩(wěn)定地結合在出芽位點，隨后成為子一代病毒粒子的結構成分。最近研究發(fā)現(xiàn)，位于 M2胞內(nèi)區(qū)尾部的兩親性螺旋(Amphipathic helix) 插入細胞膜，改變出芽部位細胞膜的彎曲度，使其斷裂，以利于病毒出芽。含有17個氨基酸的高度保守的M2兩親性螺旋位于正在出芽的病毒粒子的頸部，為細胞膜斷裂所必需，參與完成病毒出芽的最后步驟[33]。另有報道，HA、NA、M1和M2蛋白的活性可能可以循序地調(diào)試細胞膜的彎曲度而調(diào)控病毒出芽過程[34]。

一些研究探討了新合成的M2在宿主細胞質(zhì)內(nèi)的轉運過程。Rossman等通過敲除Rab11觀察M2蛋白轉運是否受影響。結果發(fā)現(xiàn)，M2在細胞表面的數(shù)量減少了 40%[33]，證明 Rab11在 M2向細胞膜轉運過程中起重要作用。有趣的是，M2蛋白高表達時會減慢HA跨膜糖蛋白通過高爾基體的轉運速率。用金剛烷胺處理后，HA的轉運不受影響，推測 HA在高爾基體內(nèi)的轉運延遲是由于有活性的 M2蛋白使高爾基體與細胞質(zhì)的pH值平衡，而不是因為胞內(nèi)轉運機器的飽和[35]。

2 vRNPs的轉運過程

vRNPs是由8條獨立的vRNA片段、聚合酶(PB2、PB1、PA) 及NP蛋白組成。vRNPs從病毒粒子中釋放，并隨后進入細胞核，在核內(nèi)復制產(chǎn)生新的vRNPs是一個極其復雜的過程。而關于該過程的研究成果也很多，可參見相關報道[36-40]。而這里主要闡述新合成的 vRNPs從細胞質(zhì)運輸?shù)郊毎ど系捻樝蜣D運過程。

新合成的 vRNPs先聚集在微管組織中心(MTOC) 附近，然后依靠NP的蛋白質(zhì)分選靶向活性，向細胞膜方向運輸[41]。因為 NS2在 M1上的結合位點遮蓋了M1的核定位信號 (NLS)，所以，可以防止vRNPs再次進入細胞核。同樣，NP通過與絲狀肌動蛋白結合，將vRNPs滯留在細胞質(zhì)內(nèi)[42]。

研究發(fā)現(xiàn)，Rab11參與vRNPs從MTOC向細胞膜轉運的過程。Rab11是Rab小分子GTPase家族的一個亞家族成員，主要位于再循環(huán)胞內(nèi)體(Recycling endosomes，RE)、TGN和質(zhì)膜上，它能調(diào)節(jié)部分蛋白和囊泡在這些細胞器之間的轉運過程[43-44]。Rab家族大約有 80個成員，其中Rab5和Rab7等也被報道參與流感病毒成分的轉運過程[45-46]。Rab5A可促進病毒從細胞表面內(nèi)吞進入早期胞內(nèi)體的轉運過程，Rab7則作用于晚期胞內(nèi)體轉運[47]。Rab11與流感病毒之間的關系曾于1998年就有報道，不論是干擾Rab11表達還是過表達GDP分解抑制物 (GDI) 都不會影響流感病毒HA向細胞膜運輸[44]。而Rab11對vRNP轉運的調(diào)控作用是近幾年才報道的。Eisfeld等利用NP的單克隆抗體結合免疫熒光法在A549細胞中定位識別vRNP，發(fā)現(xiàn)vRNPs在細胞質(zhì)轉運過程的每一個階段都與Rab11A在一起。通過抑制 Rab11A 的表達或者高表達顯性失活的Rab11A突變體，發(fā)現(xiàn)vRNP在細胞核周邊區(qū)域大量滯留，而在細胞膜上卻幾乎不聚集[48]。Amorim等也報道，有活性的Rab11與vRNP相互作用的效率比失活的 Rab11與之作用的效率高十倍[49]。最新的研究報道指出，新合成的vRNP通過病毒RNA聚合酶與Rab11相互作用，然后定位于含有活性Rab11 (GTP-bound Rab11) 的再循環(huán)胞內(nèi)體中，最后沿著微管向細胞膜轉運[50]。Amorim之前也報道說明，vRNP在細胞質(zhì)中的轉運過程需要依賴于微管的作用[49]。

值得注意的是，vRNP的聚集區(qū)域不在細胞膜上，而在其附近。所以，Rab11A可能把vRNP傳輸?shù)郊毎じ浇鼌^(qū)域后就與vRNP分開，不會同 vRNP一起進入病毒粒子。這一猜想與之前Shaw的研究結果相一致。Shaw等在純化后的流感病毒粒子中并未發(fā)現(xiàn) Rab11A[51]。Rab11在流感病毒粒子出芽時也發(fā)揮重要作用，當 Rab11的表達量減少時，病毒粒子的釋放量也隨之減少[52]。此外，Eisfeld等研究揭示，細胞內(nèi)HIV Rev結合蛋白 (HIV Rev-binding protein，HRB) 能夠促進流感病毒 vRNPs從細胞核周邊區(qū)域向細胞膜轉運。HRB能與NEP (即NS2) 在細胞核周圍相互作用，所以他們認為，NEP對該轉運過程可能也有貢獻[53]。

由此可見，vRNP從細胞核到細胞膜的轉運過程中需要多種宿主細胞成分和細胞結構參與，包括Rab11、HRB、MTOC、再循環(huán)胞內(nèi)體等。然而，vRNP轉運的詳細機制以及是否還需要其他因素的協(xié)助仍待深入研究。

3 小結

綜上，我們對流感病毒的跨膜蛋白和基因組在宿主細胞質(zhì)內(nèi)的順向轉運過程已經(jīng)有了一定的認識?？缒さ鞍譎A、NA和M2的mRNA在NXF1/TAP的作用下，進入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)開始翻譯并進行修飾，又在高爾基體中進一步修飾，然后它們分別以三聚體或四聚體的形式向細胞膜上的病毒顆粒包裝位點轉運。期間，Cdc42、Rab11分別參與NA和M2的轉運。最后它們依靠各自跨膜區(qū)上分選信號和錨定信號的調(diào)節(jié)，在病毒包裝位點有序排列，最終進入病毒粒子。新合成的vRNPs通過CRM1介導從核孔復合體 (NPC) 出核后，先通過與MTOC附近胞內(nèi)體上的Rab11結合，聚集在 MTOC周圍，然后經(jīng)微管網(wǎng)絡向細胞膜的附近區(qū)域聚集。vRNP與Rab11二者分離后，vRNP進入病毒粒子，而Rab11返回胞內(nèi)體 (圖1)。

4 展望

圖1 流感病毒跨膜蛋白和基因組在宿主細胞質(zhì)內(nèi)順向轉運過程。HA、NA和M2的mRNA出核進入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成蛋白質(zhì)。隨后蛋白轉運到高爾基體，進行糖基化等修飾，最后通過囊泡運輸?shù)男问较蚣毎ど系牟《景b位點轉運。Cdc42和Rab11分別調(diào)節(jié)NA和M2的轉運過程。新合成的vRNPs經(jīng)CRM1途徑從NPC出核，通過與胞內(nèi)體中活化的Rab11結合，聚集在MTOC區(qū)，然后該復合物經(jīng)MTOC的微管轉運到包裝位點附近，vRNP與Rab11分開，vRNP進入病毒粒子。Fig.1 Model of the anterograde transport of the influenza A virus transmembrane proteins and genome in host cytoplasm. HA, NA and M2 mRNAs translocate to rough endoplasmic reticulum following nuclear export. Newly synthesized proteins are modified in ER and then transported to the Golgi, where they are further modified by

流感病毒顆粒的形態(tài)發(fā)生是病毒致病的關鍵步驟。當包裝流感病毒的所需組分有序地聚集于細胞膜特定位點，為病毒的包裝做好準備時，病毒開啟其包裝機制，包裝出成熟的子一代病毒粒子。包裝病毒的所需組分缺失或排列混亂時，會嚴重影響病毒的形態(tài)發(fā)生過程[1]。由此可見，病毒組分的轉運過程必須受到嚴格的時間和空間調(diào)控。然而，病毒組分在宿主細胞轉運過程的時空調(diào)控機理仍然所知甚少，有待于系統(tǒng)深入的研究。值得注意的是，病毒各組分之間還存在著微妙的平衡關系。如當HA與唾液酸之間的親和力增強時，NA切除受體的活性就會受到阻礙，從而使病毒的釋放量減少；M2表達量過高時會影響HA的轉運。這些現(xiàn)象都暗示著，流感病毒的轉運、包裝和釋放是極其復雜的過程，它不僅依賴于宿主細胞的轉運機器，還要求自身各組分之間相互協(xié)調(diào)、作用及達到量效平衡關系。而目前我們對流感病毒這方面的研究雖然已經(jīng)有了一定的基礎，但是還遠不夠透徹，不論是病毒與宿主細胞之間，還是病毒各組分之間，都有許多未知的相互作用因素需要我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)?；趯α鞲胁《镜鞍缀突蚪M結構和功能的不斷闡明，相信它們在細胞質(zhì)內(nèi)的轉運過程及其機制也會被不斷揭曉。glycosylation and so on. Finally, these transmembrane proteins are transported to the virion budding site of apical plasma membranes. Cdc42 and Rab11 regulate the transport of NA and M2, respectively. Newly synthesized vRNPs translocate to cytoplasm from the nucleus through CRM1 pathway. Then vRNPs move to recycling endosomes carrying Rab11, and associate with Rab11 vesicles adjacent to the MTOC. The Rab11-vRNP complex is then transported to the virion budding site along the microtubule network.

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