阿特拉津高效降解菌株的篩選和降解特性研究*

朱 靜,李鐵晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080）

阿特拉津,商品名莠去津，英文名Atrazine（ATZ），化學(xué)名稱:2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-1，3，5-三嗪。作為一種三嗪類除草劑，阿特拉津成本低且除草效果好，在世界范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用[1]。由于多年的大量使用，殘留期長(zhǎng)，形成了對(duì)土壤、水體等自然媒介的污染，在環(huán)境水體中檢出率較高[2，3]。目前，阿特拉津已經(jīng)被認(rèn)定為內(nèi)分泌干擾物質(zhì)（EDCs）[4]。

針對(duì)阿特拉津造成的污染問題，許多物理和化學(xué)去除方法被提出[5-7]，但去除效果都不盡理想，且生成的副產(chǎn)物不僅毒性大且更易擴(kuò)散和滲透，造成水體的污染，生物降解具有成本低、效率高、無二次污染等諸多優(yōu)點(diǎn)。目前，已報(bào)道的阿特拉津降解微生物主要以細(xì)菌為主也分離到少量真菌、放線菌和藻類等[8]。

本研究利用富集培養(yǎng)法，從污水處理場(chǎng)的污泥中分離得到1株阿特拉津高效降解菌株。對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定并對(duì)其降解特性進(jìn)行研究，以期今后對(duì)該降解菌株做進(jìn)一步的研究及ATZ污染水體的生物修復(fù)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Waterse2695高效液相色譜儀-2998紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；HITACHI掃描電子顯微鏡；HZQ-FX恒溫震蕩培養(yǎng)箱（東聯(lián)電子公司）；HVE-50高壓滅菌鍋（HIRAYAMA）等。

1.2 培養(yǎng)基

標(biāo)準(zhǔn)阿特拉津液體培養(yǎng)基（g·L-1）：KH2PO40.9，Na2HPO4·12H2O 6.5，MgSO4·7H2O 0.2，萄萄糖 3.0，阿特拉津0.5（氮源，配成10g·L-1甲醇儲(chǔ)液，高壓滅菌之前加入）。

LB 培養(yǎng)基（g·L-1）:蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，蒸餾水定容至1L。

1.3 色譜分析條件

阿特拉津濃度采用高效液相色譜法測(cè)定。色譜柱為 4.6×250mm，5μm反相 C18柱;柱溫 25℃;以乙腈和水做為流動(dòng)相，體積比為40∶60，流速為lmL·min-1；檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為200nm；進(jìn)樣量10μL。

1.4 降解菌株的分離與篩選

采用富集培養(yǎng)法，梯度馴化方式，取250mL三角瓶，裝50mL阿特拉津液體培養(yǎng)基，接種5mL污泥混合液30℃，150r·min-1振蕩培養(yǎng)。5d后取5mL培養(yǎng)液于50mL新培養(yǎng)基中，阿特拉津濃度增加到200mg·L-1重復(fù)上述步驟，每次阿特拉津濃度增加100mg·L-1，至終濃度 500mg·L-1。

1.5 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增和測(cè)序

用PCR方法，以L-1菌株的總DNA為模板，擴(kuò)增16SrRNA基因，產(chǎn)物檢測(cè)后回收純化，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。重組質(zhì)粒由北京鼎國(guó)生物公司進(jìn)行測(cè)序。用GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行菌株的16S rRNA基因序列Blast比對(duì)，搜索同源性最高的相關(guān)序列，進(jìn)行進(jìn)化樹作圖，確定菌株L-1分類。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 阿特拉津降解菌株的分離

通過富集培養(yǎng)，從城市污水處理廠的污泥混合物中分離和篩選出一株能夠降解除草劑阿特拉津的降解菌株，命名為L(zhǎng)-1。該降解菌株能夠利用阿特拉津作為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)。

2.2 降解菌株的鑒定

菌株L-1葡萄糖發(fā)酵、明膠液化和接觸酶反應(yīng)陽性，淀粉水解、甲基紅（M.R）、V-P、氧化酶反應(yīng)為陰性。于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)約24和72h后發(fā)現(xiàn)，24h的幼齡細(xì)胞呈現(xiàn)短桿狀見圖1。

圖1 幼齡細(xì)胞掃描電子顯微鏡圖（×10000）Fig.1 Scanning electron micrograph of L-1 young cells

72h的老齡菌體細(xì)胞呈現(xiàn)圓球形見圖2。表明L-1菌株細(xì)胞存在明顯的桿球變化特征。

圖2 老齡細(xì)胞掃描電子顯微鏡圖（×10000）Fig.2 Scanning electron micrograph of L-1 aging cells

將降解菌L-1的16S rRNA基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號(hào)為FJ378034，對(duì)該序列進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示與多個(gè)節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）細(xì)菌的16S rRNA基因同源性在99%以上。結(jié)合菌株形態(tài)和生理生化特征，鑒定該菌株為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）。

圖3 菌株L-1的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the 16S rRNA genes of strain and other related strains

2.3 降解菌生長(zhǎng)曲線和降解曲線

圖4 L-1菌株的生長(zhǎng)（a）的阿特拉津降解曲線（b）Fig.4 Curves of growth（a）and atrazine degradation（b）of strain L-1

由圖4菌株生長(zhǎng)和降解曲線可見，L-1菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為24～60h，此后進(jìn)入穩(wěn)定期。在前12h時(shí)阿特拉津的利用率很低，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后降解速度開始迅速加快，96h阿特拉津的降解率達(dá)到94.8%，降解效果理想。

2.4 溫度對(duì)降解的影響

在不同溫度下，考察菌株L-1對(duì)阿特拉津的降解效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-1菌株在15～30℃條件下隨著溫度的升高，降解率隨之增大。在30℃達(dá)到最大降解率約92.8%后，當(dāng)溫度繼續(xù)增加，降解率急速下降。當(dāng)溫度為40℃時(shí)僅為21.2%，表明該菌株不能耐受較高溫度，這與很多節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）細(xì)菌類似。

圖5 溫度對(duì)阿特拉津降解率的影響Fig.5 Effect of temperature on atrazine biodegradation

2.5 pH值對(duì)降解的影響

不同的初始pH值對(duì)降解效果的考查發(fā)現(xiàn)，菌株L-1在pH值為6時(shí)降解效率理想，降解效率為82.2%，說明L-1菌株能適應(yīng)一定的弱酸環(huán)境；在pH7～8范圍內(nèi)，降解率達(dá)到最大，96h的最大降解率為94%左右；當(dāng)pH＞8時(shí)，隨著pH的逐漸升高，降解率隨之減少，至pH值為10時(shí)，降解效率只有45%左右；因此，L-1菌株的最佳pH值范圍為7～8。

圖6 pH值對(duì)阿特拉津降解率的影響Fig.6 Effect of pH on atrazine biodegradation rate

3 結(jié)論

（1）通過富集培養(yǎng)法，從污水處理場(chǎng)的污泥中分離得到1株阿特拉津高效降解菌株，命名為L(zhǎng)-1。通過菌體形態(tài)觀察并結(jié)合生理生化反應(yīng)及16S rRNA鑒定，判斷該菌為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）。

（2）將L-1接種于500mg·L-1的阿特拉津無機(jī)鹽培養(yǎng)基，96h對(duì)阿特拉津的降解率達(dá)到94.8%，降解效果理想。通過室內(nèi)降解效果優(yōu)化試驗(yàn)，確定菌株L-1對(duì)阿特拉津最佳降解條件:溫度為30℃，初始pH值范圍為7～8。

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