應(yīng)用雞胚活體電轉(zhuǎn)GFP示蹤技術(shù)觀察脊髓左右兩側(cè)神經(jīng)元纖維投射①

楊慈清 石曉衛(wèi) 胡阿珍 賈陽陽 郭志坤 林俊堂 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系，新鄉(xiāng)453003)

應(yīng)用雞胚活體電轉(zhuǎn)GFP示蹤技術(shù)觀察脊髓左右兩側(cè)神經(jīng)元纖維投射①

楊慈清 石曉衛(wèi) 胡阿珍②賈陽陽②郭志坤②林俊堂 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系，新鄉(xiāng)453003)

目的:探索雞胚發(fā)育過程中，脊髓左右側(cè)神經(jīng)元經(jīng)纖維之間的聯(lián)系，為脊髓兩側(cè)神經(jīng)纖維投射提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ);方法:采用雞胚帶殼開窗培養(yǎng)技術(shù)，待胚胎發(fā)育至第3天，通過活體電轉(zhuǎn)基因，將pCAGGS-GFP質(zhì)粒0.1～0.5 μl準(zhǔn)確注射到脊柱，在電壓18 V、每次脈沖60 ms，間隔100 ms，電脈沖6次的條件下進(jìn)行定時定位活體電轉(zhuǎn)基因，電轉(zhuǎn)后6小時開始到10天，分別收集胚胎，甲醛固定冰凍切片，DAPI染細(xì)胞核觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果:電轉(zhuǎn)后6小時便可以觀察到GFP的表達(dá)，24小時后可以看到GFP標(biāo)記細(xì)胞纖維的投射，3天可以清晰的觀察到轉(zhuǎn)入GFP一側(cè)脊髓的運動神經(jīng)元纖維束投射到另外一側(cè)脊髓。結(jié)論:電轉(zhuǎn)GFP成功標(biāo)記運動神經(jīng)元纖維在脊髓左右兩側(cè)的投射。

雞胚;胚胎發(fā)育;活體電轉(zhuǎn);纖維投射

脊椎動物胚胎發(fā)育是一個非常復(fù)雜的過程，而神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育較其他系統(tǒng)要早，神經(jīng)系統(tǒng)來源于神經(jīng)外胚層，由神經(jīng)管和神經(jīng)嵴分化而來，在早期胚胎發(fā)育過程中，神經(jīng)嵴是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的原基，神經(jīng)管是中樞神經(jīng)的原基，神經(jīng)管的頭段分化為腦，尾段分化為脊髓。如果神經(jīng)管沒有完全閉合就會引起多種類型先天畸形，如脊柱裂、腦裂等。在神經(jīng)管不同的部位存在不同的神經(jīng)細(xì)胞，如神經(jīng)管側(cè)板背側(cè)的成神經(jīng)細(xì)胞分化為感覺神經(jīng)元，而運動神經(jīng)元由側(cè)板腹側(cè)成神經(jīng)細(xì)胞分化而來[1]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元纖維存在交互作用[2，3]，Lodin[4]在雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織培養(yǎng)過程中觀察到軸-軸或軸-體突觸。腦中不同神經(jīng)元具有不同的功能，目前，對其神經(jīng)纖維的投射研究較多[5，6]，但對于脊髓中神經(jīng)纖維的投射研究較少，尤其是胚胎發(fā)育過程，楊琳等[7]曾以成年大鼠作為動物模型，應(yīng)用辣根過氧化物酶逆行標(biāo)記左右側(cè)脊神經(jīng)節(jié)間纖維的聯(lián)系。本研究以雞胚為動物模型，采用活體原位電轉(zhuǎn)GFP技術(shù)，利用GFP蛋白自發(fā)熒光的特點，研究胚胎發(fā)育過程脊髓左右兩側(cè)神經(jīng)元纖維的投射，為脊髓兩側(cè)神經(jīng)纖維的聯(lián)系提供形態(tài)學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 pCAGGS-GFP(綠色熒光蛋白)質(zhì)粒由Redies博士饋贈，本實驗室擴(kuò)繁提取;一抗mouse anti Neurofilament單克隆抗體(武漢博士德);二抗Goat anti mouse Cy3標(biāo)記(中杉金橋);Mounting Medium with DAPI(中杉金橋);質(zhì)粒DNA大量提取試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司);種雞蛋(本地種雞場);CUY-21(BEX)型多功能活體電轉(zhuǎn)儀(日本NEPA公司);M205FA型倒置體視熒光顯微鏡(德國Leica公司);Nikon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡(日本Nikon);CM1850冰凍切片機(jī)(德國Leica)。

1.2 方法

1.2.1 原位電轉(zhuǎn)基因方法 轉(zhuǎn)染具體過程，雞胚帶殼開窗培養(yǎng)，待胚胎發(fā)育到第3天，取出雞胚，側(cè)面開口2～3 cm直徑大小，在體視顯微鏡下，使用毛細(xì)管注射針，將 2 μg/μl的 pCAGGS-GFP 質(zhì)粒 0.1 ～0.5 μl準(zhǔn)確注射到脊髓腔，用針狀電極置脊椎兩側(cè)，確保電極與組織之間有一定空隙，使用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)電壓18V，每次電擊60 ms，間隔100 ms，電脈沖6次，整個過程在無菌操作工作臺內(nèi)完成，轉(zhuǎn)染后分別在6、12、24、48、72 小時和第10 天各取出 3 個轉(zhuǎn)染胚胎，在倒置體視熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，電轉(zhuǎn)部位呈現(xiàn)綠色熒光者(綠色熒光蛋白GFP顏色)視為陽性。1.2.2 取材及切片 倒置體視熒光顯微鏡下觀察陽性表達(dá)的胚胎，在體視顯微鏡下，采用尖頭鑷子劃破卵黃膜，取出整個胚胎，轉(zhuǎn)移至4℃預(yù)冷處理的PBS液漂洗2～3次，置于4%PFA(多聚甲醛)中，置保溫盒冰塊中搖床搖晃過夜，取出組織，吸干液體，轉(zhuǎn)移到18%蔗糖溶液置冰盒中搖晃過夜，等組織沉淀到管底時取出組織吸干液體，根據(jù)組織大小，用錫箔紙做好模型，用OCT包埋，注意方向，頭朝上，確定好位置，置于液氮中冷凍后放－80℃冰箱保存，切片時取出已包埋的組織，在冰凍切片機(jī)上連續(xù)切片，一次5～10張載玻片，每張片子根據(jù)組織大小循環(huán)貼2～3行，5～10列，切片后置烤片機(jī)37℃烤片30分鐘以上，置 －80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 熒光免疫組織化學(xué)染色 從－80℃低溫冰箱中取出的冰凍切片40℃干燥20分鐘，4%PFA中4℃固定15分鐘，用1×TBS清洗三次，每次5分鐘，在含0.1%Triton X-100的1×TBS中再孵育5分鐘。每張載玻片上加1 ml免疫組化封閉液，濕盒中孵育1小時。去除封閉液后每張載玻片加300 μl經(jīng)用封閉液稀釋的合適濃度Mouse anti Neurofilament(1∶300)一抗，對照組一抗稀釋液中不加抗體，4℃孵育過夜后，1×TBS清洗三次，每次5分鐘，然后每張片加300 μl用封閉液稀釋的用Cy3標(biāo)記的Goat anti mouse二抗，室溫孵育1小時后，用1×TBS清洗三次，每次5分鐘。最后滴加DAPI封片劑染色10分鐘，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 圖像處理分析 用Photoshop CS3軟件處理圖片，可將兩種染色同位疊加在一起，從而分析不同蛋白質(zhì)的表達(dá)定位。

2 結(jié)果

2.1 脊髓左右兩側(cè)神經(jīng)元纖維投射 脊髓活體電轉(zhuǎn)能夠?qū)崿F(xiàn)基因的定時和定位轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染過程中能夠準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)染到一側(cè)脊髓(如圖1所示)，而另外一側(cè)可以直接作為對照組，在轉(zhuǎn)染過程中，很好的控制GFP只轉(zhuǎn)染到一側(cè)的脊髓神經(jīng)元內(nèi)，在本實驗中，利用其單側(cè)轉(zhuǎn)染特點，進(jìn)行神經(jīng)元遷移和纖維投射的研究。在實現(xiàn)定位轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上，根據(jù)轉(zhuǎn)染時間的不同可以觀察被標(biāo)記神經(jīng)元的遷移及神經(jīng)纖維的投射狀況，轉(zhuǎn)染后6小時便可以觀察到GFP的表達(dá)(圖1A)，24小時可以觀察到被標(biāo)記神經(jīng)元纖維投射現(xiàn)象(圖1B)，隨著時間的延長，投射現(xiàn)象的標(biāo)記更加清晰，相對隨著時間的延長，熒光表達(dá)強度有所降低，而將胚胎培養(yǎng)到第10天即3天轉(zhuǎn)染GFP后7天時，組織切片在另外一側(cè)也可以看到少量神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP(圖1F、G星號)。圖(1D、G)中可以看到，在脊神經(jīng)節(jié)中有表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞，提示，脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有向?qū)?cè)遷移的機(jī)制。

2.2 NF及GFP雙標(biāo) 在胚胎發(fā)育第3天活體電轉(zhuǎn)5天后GFP仍呈強表達(dá)(圖2A～C)，組織切片可以清晰的觀察到表達(dá)的胞體和纖維結(jié)構(gòu)(圖2E、I)，從圖中(圖2E、I)可以看到，脊髓腹側(cè)中間運動神經(jīng)元(Medial motor neuron column)纖維跨越底板(Floor plate)下方的腹側(cè)白質(zhì)(Ventral white column)區(qū)到達(dá)對側(cè)脊髓的側(cè)白質(zhì)區(qū)。作為神經(jīng)骨架蛋白的指標(biāo)NF(Neurofilament)主要表達(dá)在神經(jīng)纖維，對其標(biāo)記可以反映出神經(jīng)元生長的狀態(tài)。從圖中(圖2F、J)可以看出，與對照組(圖2F)相比，實驗組(圖2J)中箭頭所示為NF陽性表達(dá)結(jié)果，從疊加圖(圖2K)可以清晰的看出，NF表達(dá)部位與GFP表達(dá)的部位吻合，屬于同一神經(jīng)纖維內(nèi)表達(dá)的蛋白。

圖1 雞胚胎發(fā)育過程脊髓兩側(cè)纖維投射Fig.1 The projection of neuron fiber in spinal cord both side during the development of chick embryo

圖2 轉(zhuǎn)入GFP雞胚NF表達(dá)Fig.2 The expression of neurofilament in chicken embryos after in vivo electroporation with pCAGGS-GFP

3 討論

細(xì)胞示蹤技術(shù)是跟蹤細(xì)胞遷移和神經(jīng)纖維投射最常用的方法，目前，示蹤技術(shù)多用生物素葡聚糖胺或辣根過氧化物酶進(jìn)行局部注射跟蹤，最后通過顯色劑顯色，便可以觀察到細(xì)胞從特定位置遷移途徑或纖維投射的方向。而綠色熒光蛋白GFP是近年來廣泛使用的報告基因表達(dá)蛋白，其特點是不需要特殊的染色或顯色劑顯色，在熒光顯微鏡下便可以發(fā)出綠色熒光，與其他生物素化或酶標(biāo)記的底物相比，觀察更為方便，定位準(zhǔn)確，無毒副作用等，隨著活體電轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，GFP被作為活體內(nèi)電轉(zhuǎn)基因過程中的報告基因被廣泛使用，可以將目的基因與GFP構(gòu)建成融合基因，通過載體上共用啟動子共同轉(zhuǎn)錄表達(dá)，或在同一種表達(dá)載體上，通過不同啟動子轉(zhuǎn)錄表達(dá)，也可以將目的基因與GFP共轉(zhuǎn)染，通過GFP可以確定目的基因表達(dá)狀況，進(jìn)一步檢測。通過前期的實驗已經(jīng)證明，GFP的表達(dá)并不影響雞胚胎發(fā)育及相關(guān)蛋白的表達(dá)，可以作為活體基因轉(zhuǎn)染中的報告基因，在本實驗中利用活體原位電轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在實現(xiàn)定時定位和定向轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上，對脊髓左右側(cè)神經(jīng)元纖維投射的聯(lián)系進(jìn)行示蹤，從結(jié)果中可以看到，由于電轉(zhuǎn)過程，質(zhì)粒帶負(fù)電荷會向電場的正極進(jìn)行移動，在電脈沖情況下，細(xì)胞膜通透性會變化，瞬時進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，利用表達(dá)載體自身的系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成，示蹤效果明顯，能夠很直觀的觀察到神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的投射。

在實驗過程中，也對轉(zhuǎn)染后不同時間的胚胎取材，觀察示蹤結(jié)果，從結(jié)果中看出，pCAGGS-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后6小時便會觀察到GFP的表達(dá)，24小時時會看到神經(jīng)纖維中GFP的表達(dá)，根據(jù)熒光可以看出纖維投射的方向，這種結(jié)果在48小時后更為清楚，但隨著時間的延長GFP的表達(dá)會減弱，在胚胎發(fā)育的第10天即轉(zhuǎn)入GFP質(zhì)粒7天后觀察時，發(fā)現(xiàn)熒光強度不是很強，但纖維的聯(lián)系非常清楚，除纖維聯(lián)系外，可以觀察到少量細(xì)胞向?qū)?cè)遷移，即說明在脊髓兩側(cè)進(jìn)行著必要的聯(lián)系。劉娜等[8]在成年大鼠上采用生物素化葡聚糖胺逆行標(biāo)記技術(shù)研究結(jié)果證明，一側(cè)背根節(jié)神經(jīng)元纖維可到達(dá)兩側(cè)背角及背外側(cè)束，左右側(cè)脊神經(jīng)節(jié)間的聯(lián)系纖維走行的位置可能主要位于中央管后方，且與后連合核有關(guān)，在本研究中主要選擇早期雞胚胎發(fā)育過程，根據(jù)GFP表達(dá)可以看出，脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以從一側(cè)遷移至對側(cè)，中間運動神經(jīng)元纖維經(jīng)腹側(cè)白質(zhì)到達(dá)對側(cè)，而側(cè)運動神經(jīng)元纖維向下角外投射，提示中間運動神經(jīng)元與對側(cè)存在必要聯(lián)系，側(cè)運動神經(jīng)元纖維通過神經(jīng)節(jié)間隙聯(lián)系到脊髓外組織。

實驗中對神經(jīng)絲蛋白進(jìn)行標(biāo)記，神經(jīng)絲蛋白是神經(jīng)細(xì)胞的骨架蛋白，為大直徑有髓軸突含量最高的成分，是反映神經(jīng)元功能狀況的內(nèi)在標(biāo)志物[9]。免疫組織化學(xué)染色檢測NF可以較靈敏地反映神經(jīng)軸突的形態(tài)變化。NF是構(gòu)成神經(jīng)元胞體和神經(jīng)軸突細(xì)胞骨架的主要成分，在維護(hù)神經(jīng)元的功能和軸漿轉(zhuǎn)運等一系列與脊髓損傷修復(fù)相關(guān)的病理生理變化中發(fā)揮著重要作用。故NF作為神經(jīng)骨架蛋白的指標(biāo)，可提示神經(jīng)元生長的狀態(tài)[10]。在結(jié)果中看到，NF表達(dá)與GFP在纖維中的表達(dá)部位重疊，提示GFP也是在細(xì)胞骨架中，根據(jù)其能夠明顯的標(biāo)記出細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，同時也能夠清晰觀察到纖維結(jié)構(gòu)，本研究只局限于胚胎發(fā)育過程中的纖維投射，對于成體纖維投射還待于進(jìn)一步研究。

1 孔衛(wèi)國，吳曉牧，張昆南et al.誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向運動神經(jīng)元分化的研究[J].江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009;49(9):1-4.

2 Xu G Y，Zhao Z Q.Cross-inhibition of mechanoreceptive inputs in dorsal root ganglia of peripheral inflammatory cats[J].Brain Res，2003;970(1-2):188-194.

3 Devor M，Wall P D.Cross-excitation in dorsal root ganglia of nerve-injured and intact rats[J].J Neurophysiol，1990;64(6):1733-1746.

4 Lodin Z，F(xiàn)altin J，Booher J et al.Fiber formation and myelinization of cultivated dissociated neurons from chicken dorsal root ganglia:an electron microscopic and scanning electron microscopic study[J].Neurobiology，1973;3(2):66-87.

5 潘 劍，黃紹明，陳婷婷et al.大鼠小腦旁絨球的傳入纖維投射[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010;27(3):368-369.

6 Lois J H，Rice C D，Yates B J.Neural circuits controlling diaphragm function in the cat revealed by transneuronal tracing[J].J Appl Physiol，2009;106(1):138-152.

7 楊 琳，劉 娜，楊連雪et al.應(yīng)用辣根過氧化物酶逆行示蹤技術(shù)觀察左右側(cè)脊神經(jīng)節(jié)間纖維聯(lián)系[J].中國臨床康復(fù)，2005;9 (41):32-33.

8 劉 娜，楊連雪，楊 琳et al.應(yīng)用生物素化葡聚糖胺順行示蹤技術(shù)探索左右側(cè)脊神經(jīng)節(jié)間纖維的聯(lián)系[J].中國臨床康復(fù)，2005; 9(41):22-24.

9 李曉捷，宋 銳，孫忠人.針刺對腦損傷仔鼠腦神經(jīng)絲蛋白表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐，2009;15(3):206-207.

10 Uchida K，Baba H，Maczawa Y et al.Progressive changes in neurofilament proteins and growth associated protein-43 immunoreactivities at the site of cervical spinal cord compression in spinal hyerostotic mice[J].Spine，2002;27(5):480-487.

[收稿2011-11-20 修回2012-03-16]

(編輯 倪 鵬)

Observation of projections between the left and right spinal cord neuron fibers with electroporation GFP tracing technique in vivo of chick embryo

YANG Ci-Qing，SHI Xiao-Wei，HU A-Zhen，JIA Yang-Yang，GUO Zhi-Kun，LIN Jun-Tang.Department of Life Science and Technology，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China

Objective:To explore the connection between the left and right side spinal cord neurons fiber during the development of the chick embryo，in order to provide the morphological basic information for the projection of the nerve fibers on both sides of the spinal cord.MethodspCAGGS-GFP was transformed into spinal cord of chicken embryos which was used to in ovo culture technique until the embryos developed to 3 d.The condition of in vivo electroporation was voltage 18 V，each pulse 60 ms，interval 100 ms and 6 times pulse.The embryo after electroporation from 6 hours to 10 days were collected and fixed with 4%PFA and frozen sections，nucleus was stained with DAPI.ResultsThe GFP expression was be observed at the time of 6 hours after in vivo electroporation，the projection of fiber which was labeled GFP was observed after 24 hours and three days later the spinal cord motor neuron fibers projected onto the other side of the spinal cord was clearly obserred.ConclusionIn vivo electroporation GFP successfully marked motor neuron fibers projection between the two sides of the spinal cord during the development of chick embryo.

Chick embryo;Embryo development;In vivo electroporation;Fiber projection

Q954.48

A

1000-484X(2012)08-0718-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.010①本文為2010年國家自然科學(xué)基金(No.31000475)和2011年新鄉(xiāng)

醫(yī)學(xué)院重點研究領(lǐng)域招標(biāo)課題資助項目(No.ZD2011-26)②新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省醫(yī)用組織再生重點實驗室，新鄉(xiāng)453003

楊慈清(1979年－)，男，在讀博士，講師，主要從事發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)研究;

及指導(dǎo)教師:林俊堂(1976年－)，男，博士，主要從事發(fā)育生物學(xué)方面研究，E-mail:linjuntang2002@yahoo.co.uk。

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