TLR2胞外段特異性抗體對(duì)TLR2激動(dòng)劑誘導(dǎo)的炎癥和促過(guò)敏反應(yīng)的抑制作用①

潘慶軍 劉 淵 朱 平 侯曉睿 劉艷君

(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣州510515)

TLR2胞外段特異性抗體對(duì)TLR2激動(dòng)劑誘導(dǎo)的炎癥和促過(guò)敏反應(yīng)的抑制作用①

潘慶軍②劉 淵 朱 平 侯曉睿 劉艷君

(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣州510515)

目的:觀察小鼠TLR2胞外段抗原肽特異性抗體對(duì)TLR2激動(dòng)劑誘導(dǎo)的炎癥和促過(guò)敏反應(yīng)的影響。方法:用小鼠TLR2胞外段單表位抗原肽(T20)免疫動(dòng)物制備抗體(T20抗體);體外觀察T20抗體對(duì)PGN和LTA刺激RAW264.7細(xì)胞生成TNF-α和IL-6的影響，用ELISA法檢測(cè)各組TNF-α和IL-6量;體內(nèi)觀察T20抗體對(duì)OVA致敏小鼠PGN致死性攻擊的影響，記錄各組直腸溫度變化和死亡率。結(jié)果:獲得小鼠TLR2特異性T20抗體;該抗體可抑制TLR2激動(dòng)劑(PGN和LTA)對(duì)相應(yīng)靶細(xì)胞的刺激作用，使其生成的TNF-α和IL-6顯著降低;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)T20抗體對(duì)PGN加劇的過(guò)敏反應(yīng)具有抑制作用。結(jié)論:T20抗體可特異結(jié)合小鼠TLR2，抑制TLR2激動(dòng)劑誘導(dǎo)的炎癥及TLR2激動(dòng)劑加劇的過(guò)敏反應(yīng)。

TLR2;胞外段表位;抗體;炎癥;過(guò)敏

Toll樣受體 2(Toll like receptor 2，TLR2)是TLRs家族成員中表達(dá)范圍最廣、識(shí)別病原微生物及其產(chǎn)物種類最多的分子之一，廣泛分布于單核-巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞表面，可識(shí)別肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)、Pam3Cys、酵母多糖、HSP60、透明質(zhì)酸、凋亡核小體和高遷移率族蛋白1(HMGB1)等多種配基[1-7]。上述配基與TLR2作用后，可引起性質(zhì)相似的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)，產(chǎn)生類似的炎性細(xì)胞因子。TLR2激動(dòng)劑可介導(dǎo)產(chǎn)生抗感染、抗腫瘤等對(duì)機(jī)體有利的作用，也能誘到產(chǎn)生對(duì)機(jī)體不利的炎癥和過(guò)敏反應(yīng)[8，9]。因此，特異性阻斷 TLR2介導(dǎo)的炎癥和超敏反應(yīng)信號(hào)通路，可能為感染、過(guò)敏及自身免疫等多種疾病機(jī)理研究和防治提供新的策略。

本實(shí)驗(yàn)擬用小鼠TLR2胞外段表位(20 mer合成肽)作為抗原獲得相應(yīng)單表位特異性抗體—抗T20，研究該抗體對(duì)TLR2激動(dòng)劑誘導(dǎo)的過(guò)敏機(jī)體炎癥表現(xiàn)的影響，分別在體外以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為模型，在體內(nèi)以O(shè)VA主動(dòng)過(guò)敏小鼠為模型進(jìn)行相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物和細(xì)胞 新西蘭大白兔和BALB/c小鼠由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。RAW264.7細(xì)胞為本室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 卵白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)和弗氏佐劑購(gòu)自Sigma公司;Bluecarrier蛋白(BC)、碳二亞胺(EDC)、BCA試劑盒和抗小鼠IgE-HRP購(gòu)自Pierce公司;Sepharose 4B購(gòu)自Amersham(Pharmacia)公司;小鼠商品化 TLR2抗體T2.5購(gòu)自Biolegend公司;PGN購(gòu)自Fluca公司;兔無(wú)關(guān)對(duì)照抗體，抗小鼠IgG、IgE-HRP，F(xiàn)ITC-羊抗鼠和FITC-羊抗兔，TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。1.2 方法

1.2.1 抗原肽的設(shè)計(jì)與合成 以我們前期預(yù)測(cè)獲得的小鼠TLR2胞外段編碼氨基酸序列(DSQS LKSI RDIH HLTL HLSE)為模板，采用哈佛大學(xué)分子免疫基金會(huì)在線提供的抗原肽預(yù)測(cè)軟件(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html#Directions)預(yù)測(cè)抗原表位，由深圳翰宇公司合成。

1.2.2 免疫原的制備 在EDC存在的條件下，分別按常規(guī)方法將抗原肽分別與BC、BSA和兔IgG交聯(lián)，獲得抗原肽-BC交聯(lián)物、抗原肽-BSA交聯(lián)物和兔IgG-抗原肽交聯(lián)物(rIgG-T20交聯(lián)物)。

1.2.3 動(dòng)物免疫 以抗原肽-BC偶聯(lián)物為免疫原對(duì)2只新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，共免疫6次，每次抗原的用量為1 mg(按載體蛋白計(jì))，免疫過(guò)程按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.2.4 抗T20抗體檢測(cè)和純化 第6、8周采血，以抗原肽-BSA偶聯(lián)物為包被抗原(10 μg/ml)，以免疫前血清為陰性對(duì)照，采用間接ELISA方法檢測(cè)IgG抗體滴度。

Sepharose 4B-rIgG-T20交聯(lián)物制備:取已制備的 rIgG-T20 交聯(lián)物 2.5 ml(1 mg/ml)，于 0.1 mol/L NaHCO3(pH8.3)透析1小時(shí)。稱取0.75 g溴化氫活化的 Sepharose 4B，以1 mmol/L冷 HCl使其膨脹，并加入G3砂心漏斗，15分鐘內(nèi)用150 ml冷1 mmol/L HCl沖洗凝膠，并用 0.1 mol/L NaHCO3快速抽干后與透析過(guò)的rIgG-T20交聯(lián)物混合，室溫翻轉(zhuǎn)振蕩孵育2小時(shí)。加入5 ml的0.2 mol/L甘氨酸(pH8.0，碳酸鹽緩沖液)室溫孵育2小時(shí)，以封閉未結(jié)合的基團(tuán)。裝入置層析柱中后用0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液 pH4.0(含 0.5 mol/L NaCl)和 0.1 mol/L NaHCO3pH8.3(含0.5 mol/L NaCl)交替反復(fù)洗柱5遍。用1個(gè)柱床體積3 mol/L KCNS洗柱，用含0.2%NaN3PBS(0.01 mol/L，含0.5 mol/L NaCl)洗柱5倍柱長(zhǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

抗血清純化:每次取抗原肽-BC偶聯(lián)物免疫的兔血清10 ml以10 mmol/L PBS(pH7.4)緩沖液稀釋3倍，0.45 μm孔徑濾膜過(guò)濾除雜質(zhì)，加入層析柱，0.8 ml/min，重復(fù)上樣 1 次，PBS(pH7.4)緩沖液洗滌10個(gè)床體積，然后用0.15 mol/L Gly-HCl pH2.5洗脫10個(gè)床體積，收集流出液1 ml/管，立即以1 mol/L Tris-HCl(pH9.0)中和至 pH7.2 ～7.4，以BCA試劑盒定量。

1.2.5 T20抗體鑒定 取正常培養(yǎng)的 RAW264.7細(xì)胞，胰酶消化收集，分別以1×106細(xì)胞與T2.5(1 μg/test)，抗 T20(1 μg/test)，抗 T20(1 μg/test)+ T20(1 μg/test)室溫反應(yīng)30分鐘，兔無(wú)關(guān)抗體做對(duì)照，用含1%BSA的PBST洗滌3次，350 g/5分鐘離心，再加入FITC-羊抗鼠或FITC-羊抗兔，室溫避光30分鐘，洗滌2次，重懸于200 μl洗滌液上機(jī)檢測(cè)或涂片熒光顯微鏡檢測(cè)，其他步驟按常規(guī)進(jìn)行。

1.2.6 T20抗體對(duì)PGN和LTA刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥因子釋放的影響 收集正常培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞，106細(xì)胞/孔接種于六孔板，含 5%的牛血清的IMDM培養(yǎng)基，于37°C 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按 PGN(1 μg/ml)，PGN(1 μg/ml)+T20抗體 (1 μg/ml)和 PGN(1 μg/ml)+T20 抗體(5 μg/ml)分組，共培養(yǎng)6和12小時(shí)后分別收集各組上清，凍存于-40℃待檢測(cè)TNF-α和IL-6水平。

1.2.7 T20抗體對(duì)PGN誘導(dǎo)的過(guò)敏性炎癥反應(yīng)的影響 ①OVA過(guò)敏模型的建立和指標(biāo)檢測(cè):6～8周BALB/c小鼠分別于第0、10、20天用Al(OH)3和OVA(100 μg/只)乳化后腹部皮下多點(diǎn)免疫，第21天分別檢測(cè)抗OVA IgG和IgE抗體水平。尾靜脈OVA攻擊劑量為30 mg/kg。②T20抗體對(duì)PGN加劇OVA致敏小鼠過(guò)敏反應(yīng)的影響:OVA致敏小鼠模型建立后，選擇OVA抗體滴度一致的小鼠，分為以下4組:第一組，即OVA(30 mg/kg)激發(fā)組;第二組，即 OVA(30 mg/kg)+PGN(100 μg/只)加劇實(shí)驗(yàn)組;第三組，即 OVA(30 mg/kg)+PGN(100 μg/只)+T20抗體(100 μg/只)干預(yù)實(shí)驗(yàn)組;第四組，即同型抗體陰性對(duì)照組[OVA(30 mg/kg)+PGN(100 μg/只)+ 兔無(wú)關(guān)抗體(100 μg/只)]。分別記錄直腸溫度變化和死亡率。

2 結(jié)果

2.1 TLR2胞外段20肽的合成和抗原性預(yù)測(cè) T20序列為:DSQS LKSI RDIH HLTL HLSE(TLR2′s extracellular domain)，經(jīng)軟件預(yù)測(cè)T20僅含一個(gè)單表位抗原決定簇。

2.2 T20抗體鑒定 以小鼠TLR2胞外段抗原肽-BC交聯(lián)物免疫家兔獲得抗血清約80 ml。以抗原肽-BSA偶聯(lián)物為包被抗原(10 μg/ml)，T20抗體滴度約1∶100萬(wàn)。以Sepharose 4B-rIgG-20肽親和純化T20抗體，以BCA試劑盒(Pierce公司)定量，得到T20抗體為12.8 mg(共2 ml)。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示T20抗體(r-anti-T20)可以和RAW264.7細(xì)胞結(jié)合，而且這種結(jié)合可以被TLR2胞外段T20肽阻斷(圖1)。熒光顯微鏡也顯示T20抗體可以和RAW264.7細(xì)胞結(jié)合(圖2)。

2.3 T20抗體抑制 PGN和 LTA刺激 RAW264.7細(xì)胞TNF-α和 IL-6的產(chǎn)生 PGN(1 μg/ml)刺激RAW264.7細(xì)胞6小時(shí)和12小時(shí)可誘導(dǎo) TNF-α和 IL-6的產(chǎn)生，T20抗體 (1和5 μg/ml)可顯著抑制由PGN刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的 TNF-α和IL-6。LTA(0.1 μg/ml)刺激 RAW264.7 細(xì)胞 6 小時(shí)和12小時(shí)同樣可誘導(dǎo)TNF-α和 IL-6的產(chǎn)生，T20抗體(0.1 和 0.5 μg/ml)可顯著抑制由 PGN刺激 RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的 TNF-α和 IL-6 (圖3)。

2.4 T20抗體抑制PGN誘導(dǎo)的致死性過(guò)敏性反應(yīng)

2.4.1 OVA過(guò)敏模型參數(shù) 以O(shè)VA為包被抗原(10 μg/ml)，其他按常規(guī)方法進(jìn)行，檢測(cè)OVA特異IgG抗體滴度約1∶50萬(wàn);特異OVA IgE約1∶400。

2.4.2 T20抗體抑制PGN加劇的過(guò)敏反應(yīng) OVA攻擊組小鼠發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，但無(wú)一死亡(圖4B)，該組小鼠直腸溫度注射后60分鐘后降至最低點(diǎn)，180分鐘后開(kāi)始回升，390分鐘后逐漸恢復(fù)至基礎(chǔ)體溫(圖4A);而PGN加劇組(即OVA攻擊+PGN加劇實(shí)驗(yàn)組)小鼠在注射后100分鐘內(nèi)100%死亡(圖4B)，該組小鼠直腸溫度注射后60分鐘后降至最低點(diǎn)后，未恢復(fù)(圖4A);T20抗體干預(yù)組(即 OVA攻擊+PGN+T20抗體干預(yù)抑制實(shí)驗(yàn)組)，保護(hù)部分PGN促過(guò)敏小鼠免于死亡(保護(hù)率33.3%，n=12，圖 4B)，該組小鼠直腸溫度注射后60分鐘后降至最低點(diǎn)后，部分逐漸恢復(fù)至基礎(chǔ)體溫，部分未恢復(fù)(圖4A);而同型抗體陰性對(duì)照組[OVA(30 mg/kg)+PGN(100 μg/只)+ 兔無(wú)關(guān)抗體(100 μg/只)]同PGN加劇組結(jié)果類似。

圖1 用不同抗體流式檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞表面TLR2的表達(dá)Fig.1 The expression of TLR2 on RAW264.7 detected by flow cytometry with anti-T20 or T2.5

圖2 FITC-T20抗體 熒光顯微鏡檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞表面TLR2(×400)Fig.2 The expression of TLR2 on RAW264.7 detected by fluorescence microscopy with FITC-anti-T20 (×400)

圖3 T20抗體對(duì) PGN和LTA刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和 IL-6的影響Fig.3 Effects of anti-T20 on the production of TNF-α and IL-6 by RAW264.7 stimulated with PGN or LTA

圖4 T20抗體對(duì)PGN刺激過(guò)敏性炎癥小鼠直腸溫度和死亡率的影響Fig.4 Effects of anti-T20 on the rectal temperature and survival rate of OVA allergic mice stimulated by PGN

3 討論

TLR2胞外段是識(shí)別和結(jié)合各種內(nèi)/外源性配基的主要結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)段則介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TLR2胞外段與胞內(nèi)段基因突變或缺失或阻斷胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可阻斷 TLR2介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)[10-13]。此外，TLR2胞外段的外源性干擾與封閉也可阻斷或影響其介導(dǎo)的效應(yīng)，如采用抗TLR2胞外段單抗或多抗也可阻斷TLR2介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)，包括對(duì)PGN、大腸桿菌脂蛋白、脂多糖及非感染因子的識(shí)別[14]。除了針對(duì)TLR2胞外段26肽(179L-204I)的多抗(Oncogen公司)，其它商品化以及實(shí)驗(yàn)室制備的抗TLR2單抗、多抗所針對(duì)的TLR2胞外段位點(diǎn)尚不十分清楚，因而不利于TLR2胞外段與配基的相互識(shí)別機(jī)制的研究。本課題組采用蛋白質(zhì)抗原表位預(yù)測(cè)及合成肽技術(shù)，選擇TLR2胞外段的優(yōu)勢(shì)表位抗原，避免了小鼠全長(zhǎng)及胞外段表達(dá)蛋白誘導(dǎo)的多位點(diǎn)抗體在活性鑒定方面的復(fù)雜性。

已知抗細(xì)胞膜受體分子的抗體結(jié)合相應(yīng)的表位后，其作用可能是抑制或興奮，這與抗體所針對(duì)的表位、應(yīng)用途徑、劑量及時(shí)相等因素有關(guān)[15]，我們分別用了2種 TLR2的激動(dòng)劑(PGN，LTA)刺激表達(dá)TLR2的RAW264.7細(xì)胞，抗T20均可抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本文抗T20和TLR2激動(dòng)劑同時(shí)作用于細(xì)胞，其炎癥因子生成的阻斷率達(dá)到約80%。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)提示抗T20可能是抑制性(或封閉性)的。但作用機(jī)理的闡明則有待于進(jìn)一步的研究。

鑒于發(fā)病率逐漸上升的過(guò)敏性疾病常合并感染，而感染又加重過(guò)敏反應(yīng)。我們注意到TLR2信號(hào)通路在過(guò)敏性炎癥中的作用及存在的爭(zhēng)議，可能和TLR2激動(dòng)劑或阻斷劑的種類、劑量、靶細(xì)胞類型、產(chǎn)生炎癥因子種類，以及采用的動(dòng)物過(guò)敏模型不同有關(guān)。Jeffrey等發(fā)現(xiàn)金葡菌PGN通過(guò)結(jié)合肥大細(xì)胞表面的TLR2導(dǎo)致肥大細(xì)胞釋放TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6，脫顆粒和 Ca2+通道的開(kāi)放，皮內(nèi)注射PGN可增強(qiáng)血管擴(kuò)張和TLR2依賴性的皮膚內(nèi)肥大細(xì)胞活化以及炎癥反應(yīng)[1]。同時(shí)，TLR2的合成配基Pam3Cys和PGN作為佐劑誘導(dǎo)了顯著的Th2型免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫粒，能加劇實(shí)驗(yàn)性哮喘的炎性癥狀[2，16]。另外，PGN 結(jié)合嗜堿性粒細(xì)胞表面TLR2可選擇性誘發(fā)IL-4和13的釋放而不釋放組胺和LTC4，但可增強(qiáng)由抗IgE抗體誘發(fā)的組胺和LTC4 的釋放[4]。

我們所采用的OVA主動(dòng)過(guò)敏模型為均一可控，即采用30 mg/kg OVA為非致死攻擊劑量抗原，利于觀察PGN刺激對(duì)模型的影響，也易于判斷T20抗體對(duì)PGN加劇過(guò)敏反應(yīng)炎癥的保護(hù)作用。本文檢測(cè)了過(guò)敏時(shí)的典型指標(biāo)直腸溫度變化和死亡率。在本文的OVA主動(dòng)過(guò)敏模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)制備的抗TLR2胞外段抗體可抑制TLR2激動(dòng)劑PGN加劇的致死性過(guò)敏性反應(yīng)，由此可認(rèn)為，我們所研制抗體所識(shí)別的肽段是TLR2的干預(yù)靶點(diǎn)。

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[收稿2012-02-11 修回2012-05-14]

(編輯 張曉舟)

The inhibition of antibodies against mouse TLR2 extracellular domain on the inflammation and allergic response induced by agonists of TLR2

PAN Qing-Jun，LIU Yuan，ZHU Ping，HOU Xiao-Rui，LIU Yan-Jun.Department Immunology，School of Basic Medical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China

Objective:To study the inhibitory effects of antibodies against mouse TLR2 extracellular domain on the inflammation and allergic response induced by agonists of TLR2.MethodsThe specific antibodies(anti-T20)of 20mer peptide epitope of mouse TLR2 extracellular domain(T20)were prepared by immunized T20 in rabbits.Effects of anti-T20 on PGN and LTA-driven TNF-α and IL-6 production in vitro were studied and the production of TNF-α and IL-6 were tested by ELISA.Also，the effect of anti-T20 on PGN-driven death of OVA allergic mice in vitro was studied，and rectal temperature and mortality were recorded.ResultsAnti-T20 could specifically bind with mouse TLR2 and significantly inhibit PGN and LTA-driven TNF-α and IL-6 production by RAW264.7 cells.Also，anti-T20 could partially protect OVA allergic mice from PGN-induced death.ConclusionAnti-T20 can specifically bind to mouse TLR2 and inhibit TLR2 agonist-driven inflammation and TLR2 agonist-promoting allergic response.

TLR2;Extracellular epitope;Antibody;Inflammation;Allergy

R392.12

A

1000-484X(2012)08-0685-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.003

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(No.30671970)

②同時(shí)供職于廣東醫(yī)學(xué)院腎臟疾病研究所，湛江524001

潘慶軍(1978年-)，男，醫(yī)學(xué)博士，講師，主要從事過(guò)敏和自身免疫性疾病研究;

及指導(dǎo)教師:劉艷君(1972年-)，女，副教授，主要從事天然免疫研究，E-mail:yanjun@fimmu.com。

·專題綜述·