氯化鑭對根管內(nèi)糞腸球菌抗菌效果的體外實驗

程瑞卿，李軍科，陳惠珍

(1.市眼科醫(yī)院，河北邢臺054001;2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北石家莊050000)

根管治療的目的是徹底消毒根管并進(jìn)行三維充填，阻止感染再發(fā)生。目前認(rèn)為:導(dǎo)致完善根管充填后出現(xiàn)疼痛、尖周稀疏區(qū)不消失甚至擴大、根管再感染等主要與充填后殘留在根管系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌有關(guān)。再感染根管內(nèi)最常檢測到的細(xì)菌是糞腸球菌(Enterococcus faecalis，Ef)［1-3］，因其能滲透到牙本質(zhì)小管深層，并能在長期饑餓等惡劣環(huán)境下生存，且對堿或藥物有較強的耐受性，僅通過機械化學(xué)預(yù)備、抗感染藥物沖洗和根管消毒等傳統(tǒng)方法，難以徹底清除。因此，尋找一種能抑制或殺滅根管內(nèi)糞腸球菌且安全、有效的新型根管消毒劑，對降低根管治療的失敗率有重要的臨床意義。近年研究發(fā)現(xiàn):稀土元素中的鑭具有抗菌和促進(jìn)再礦化的作用，可用于防齲，但目前尚無將氯化鑭用于根管消毒方面的報道。本研究通過體外建立糞腸球菌感染根管模型，觀察比較FC、CP、氫氧化鈣丙二醇糊劑和氯化鑭4種根管消毒劑對糞腸球菌的抗菌效果，以期對氯化鑭的抗糞腸球菌性能做出初步評價，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料和設(shè)備

甲醛甲酚(FC，上海第二醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥材料廠);樟腦酚(CP，上海運佳黃浦制藥有限公司);氫氧化鈣丙二醇糊劑(氫氧化鈣粉末0.25 mg加1 mL丙二醇配制);氯化鑭藥劑(LaCl3·7 H2O分子量371.27，純度＞99.99%)(包頭市京瑞新材料有限公司);普通血瓊脂培養(yǎng)基(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科制作);快速革蘭染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司);糞腸球菌(Ef)29212標(biāo)準(zhǔn)株(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院細(xì)菌室提供);數(shù)字顯示電子比濁儀(BD phoenix-100Sop，BD公司，美國);一次性細(xì)菌培養(yǎng)皿(浙江光電股份有限公司);生物顯微鏡(OLYMPUS.CH20，江南光電股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 氯化鑭藥液的配制和實驗濃度的確定

取378.45 mg LaCl3·7 H2O置無菌容量瓶中，用三蒸水溶解并定容25 mL，得到103μg/mL的氯化鑭原液。采用液體二倍稀釋法［4］確定氯化鑭對糞腸球菌的最低殺菌濃度(MBC)為8 192 μg/mL (33×10-3mol/L)。

1.2.2 糞腸球菌感染根管模型的建立

取正畸減數(shù)而新鮮完整拔除的單根管前磨牙72個，用52.5 g/L NaOCI液浸泡24 h后，常規(guī)開髓、拔髓，逐步后退法預(yù)備根管至#40，52.5 g/L NaOCI溶液與170 g/L EDTA溶液交替沖洗以去除玷污層。然后用高速金剛砂牙鉆切除各牙牙冠和根尖部，取長6 mm的牙根置含有25 mL牛心腦浸液(BHI肉湯)的試管中，121℃高溫高壓下滅菌20 min，靜置于50 mL/L C02培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)，24 h后觀察BHI肉湯無混濁，確定滅菌完全。從滅菌的72個牙齒中隨機抽取12個用于陰性對照，其余60個牙根均置于已制備的0.5麥?zhǔn)蠞舛燃S腸球菌液中，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)24 h，建立糞腸球菌感染根管模型。

1.2.3 根管消毒藥物處理和消毒效果觀察

將60個成功建立感染根管模型的牙根隨機分為5組，連同陰性對照組共6組，每組12個(表1)，各牙根管經(jīng)無菌生理鹽水蕩洗、紙尖吸干后，分別用無菌蠟固定于一次性細(xì)菌培養(yǎng)皿底部。按表1分組，用一次性無菌注射器將待測藥物注滿相應(yīng)組各牙根管腔后，將放置牙根的培養(yǎng)皿置50 mL/L CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后第3天和第7天，每組各取6個牙根，#25 H型銼去除根管內(nèi)消毒劑，無菌生理鹽水沖洗，無菌紙尖干燥后，用慢速G-G鉆均勻磨取各根管內(nèi)壁牙本質(zhì)粉末約4 mg，置含有20 mL BHI肉湯的試管內(nèi)，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)72 h后取試管內(nèi)上層液體，比濁儀測量細(xì)菌濁度。

在測量濁度前，各組均分別取少量上層液體接種于普通血瓊脂培養(yǎng)基，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)48 h后，經(jīng)快速革蘭染色，生物顯微鏡下鑒定細(xì)菌種類，以確保無雜菌污染。

表1 標(biāo)本分組和處理情況

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析?？傮w分析用Kruskal-Wallis H檢驗，因各組數(shù)據(jù)方差不齊且非正態(tài)分布，采用Wilcoxon秩和檢驗對6組數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

藥物處理第3天取牙本質(zhì)粉末培養(yǎng)，比濁儀檢測顯示:陰性對照組濁度最低，陽性對照組最高，兩者分別與另5組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);各藥物實驗組相比，F(xiàn)C組濁度最低，由低到高依次為: FC組＜?xì)溲趸}組＜CP組＜氯化鑭組，其中FC組與氫氧化鈣組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，且均低于其他兩組(P＜0.05);CP組與氯化鑭組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(表2)。

藥物處理7 d時，取牙本質(zhì)粉末培養(yǎng)，比濁儀檢測顯示:仍以陰性對照組濁度最低，陽性對照組最高，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);各藥物實驗組的濁度較3 d時均有所下降，且與陰性對照組均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，而與陽性對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);各藥物實驗組間相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)(表2)。

表2 藥物處理第3、7天時各組濁度值的比較(±s)

表2 藥物處理第3、7天時各組濁度值的比較(±s)

不同字母組間P＜0.05

組別 n 3 d 7 d陰性對照 6 0.068±0.012A 0.070±0.013A FC 6 0.087±0.010B 0.072±0.008A CP 6 0.110±0.014C 0.107±0.046A氫氧化鈣 6 0.090±0.009B 0.075±0.010A氯化鑭 6 0.112±0.017C 0.077±0.010A陽性對照 6 2.358±0.090D 2.882±0.027B

3 討論

根管治療術(shù)由于術(shù)者的技術(shù)水平、采用的技術(shù)方法、術(shù)后隨訪時間以及根管治療療效評價標(biāo)準(zhǔn)不同，其治療的成功率從53%到93%不等［5］。許多研究發(fā)現(xiàn):經(jīng)治根管再感染的主要細(xì)菌為糞腸球菌。糞腸球菌具有很強的滲透力，可滲透至牙本質(zhì)小管深層;并能在長期饑餓等惡劣條件下生存，在條件適宜時可大量繁殖，引起再感染;加之其對堿或藥物有較高的耐受性，目前尚缺乏針對糞腸球菌感染的理想消毒藥物。FC、CP其消毒作用已得到認(rèn)可，但由于二者均具有細(xì)胞毒性和半抗原性，目前已考慮不推薦使用。氫氧化鈣雖具有其自身獨特的抗菌活性，但擴散性較差、起效時間慢，一般需2～3周才能到達(dá)釉牙本質(zhì)界處的牙本質(zhì)外層［6］;抗菌譜較窄，對兼性厭氧菌的抑菌效果較差;難以達(dá)到滅菌所需的pH值，目前臨床上所用的氫氧化鈣多數(shù)只能達(dá)到pH值9.5～10，因此無法完全消滅糞腸球菌;根管內(nèi)長期使用氫氧化鈣會造成牙齒的抗折能力下降。

鑭是稀土元素之一，毒性小而化學(xué)性質(zhì)較活潑，其化合物氯化鑭可用于治療燒傷、妊娠期嘔吐、降壓等方面。目前，關(guān)于口腔方面的研究主要有防齲、抗菌、抗炎等，其作用對口腔內(nèi)多種細(xì)菌如牙齦卟啉單胞菌(Pg)、具核梭桿菌(Fn)、變異鏈球菌(Sm)、金黃色葡萄球菌(Sa)等有較好的抑制作用，且毒副作用小，提示其有可能成為理想的根管消毒藥。

本研究參考Haapasalo等的實驗方法［7］，選取單根管離體牙體外建立糞腸球菌感染根管模型，通過比濁法分別檢測藥物處理3 d和7 d時牙本質(zhì)粉末內(nèi)糞腸球菌的含量，來判定氯化鑭及其他根管消毒劑抗糞腸球菌的作用。結(jié)果顯示在3 d時，氯化鑭藥液的抑菌作用與CP相似，但低于FC和氫氧化鈣丙二醇糊劑。說明該藥液對糞腸球菌有一定抑制作用，但不能將其全部殺死;在7 d時，F(xiàn)C組、CP組、氫氧化鈣丙二醇糊劑組和氯化鑭組的抑菌效果接近，且與陰性對照組無顯著性差異，說明糞腸球菌全部被殺死。La3+的抗菌機制尚不清楚，有研究者認(rèn)為La3+抑菌機制是由于稀土離子與鈣離子半徑接近，是鈣離子的拮抗劑，會取代細(xì)菌中的鈣結(jié)合位點，從而使細(xì)菌活性受到抑制，甚至引起細(xì)菌死亡，從而達(dá)到抗菌作用。同時，氯化鑭的毒副作用較?。?］，適宜濃度的鑭鹽用于口腔較安全，因此，氯化鑭作為根管消毒劑，較 FC、CP、Ca (OH)2有一定的優(yōu)勢。

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