毛細(xì)管GC法測定南五味子多糖的單糖組成Δ

姚 丹，王宏軍，楊嘉玉，雷明生（遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

毛細(xì)管GC法測定南五味子多糖的單糖組成Δ

姚 丹＊，王宏軍#，楊嘉玉，雷明生（遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

Δ遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（L2010256）

＊實驗師。研究方向：藥物分析與儀器分析。電話：0416-4672307。E-mail：yaodan88abc@163.com

#通訊作者：副教授，博士。研究方向：藥物分析與飼料分析。電話：0416-4672096。E-mail：wanghj0312@yahoo.com.cn

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.23.18

目的：研究南五味子多糖中單糖的種類和組成比例。方法：以2moL·L－1硫酸溶液水解南五味子多糖，用吡啶溶解干燥的水解產(chǎn)物，硅烷化衍生；采用毛細(xì)管氣相色譜法測定南五味子多糖的單糖組成：色譜柱為SE-30石英毛細(xì)管（30m×0.25mm× 0.25μm），進(jìn)樣口溫度為220℃，檢測器溫度為230℃，柱溫為195℃。結(jié)果：南五味子多糖中含有甘露糖、木糖、半乳糖、果糖、葡萄糖和半乳糖醛酸6種單糖成分，已確定的6種單糖的摩爾比為19.78∶2.75∶0.149∶1∶0.381∶0.127。結(jié)論：該方法簡便、靈敏，可以準(zhǔn)確測定出南五味子多糖中含有的各種單糖。

毛細(xì)管氣相色譜法；大葉南五味子；多糖；單糖組成

多糖是生命代謝不可缺少的重要物質(zhì)，是多個單糖或其衍生物聚合而成的大分子活性化合物。近年來研究表明，五味子多糖具有保肝[1]、抗衰老[2]、抗腫瘤[3，4]、調(diào)節(jié)免疫[5]、降血脂[6]、鎮(zhèn)痛[7]等藥理作用。一般來說，多糖所具有的藥理活性是與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的[8，9]，故對多糖的單糖組成和摩爾比的測定是研究多糖性質(zhì)的一項較為重要的工作。苯酚-硫酸法是常用的測量多糖總含量的方法[10]，而毛細(xì)管氣相色譜（GC）法是目前測定多糖中單糖組成和摩爾比的常用方法。大葉南五味子（Kadsuramarmorata）屬于五味子科南五味子屬植物。前期研究表明，從該植物中制備的南五味子多糖（KPS）具有增強細(xì)胞免疫和體液免疫的作用[11]，但關(guān)于該植物中多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)研究均未見報道。故本試驗采用硅烷化衍生，用毛細(xì)管GC法測定了從大葉南五味子果實中分離到的KPS的單糖組成及摩爾比，以期為該植物的開發(fā)提供理論和試驗數(shù)據(jù)，為其藥理活性、作用機制的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

GC-2010plus GC儀、氫火焰離子化檢測器（FID）（日本島津公司）；安瓿熔封儀（中南制藥機械廠）；TG16-W微量高速離心機（湘儀離心機制造廠）；DHG-9245A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；FA1004N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

大葉南五味子產(chǎn)于貴州，由貴州中醫(yī)院饋贈并鑒定為真品。甘露糖（分析純，天津虔誠偉業(yè)科技發(fā)展有限公司）；D（-）阿拉伯糖（生物試劑，上海晶純試劑有限公司）；L-鼠李糖、D-核糖、D-木糖（生物試劑，上?；菔郎噭┯邢薰荆籇-果糖（生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司）；半乳糖（生物試劑，鄭州興人精細(xì)化工有限公司）；葡萄糖（分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；D（+）-半乳糖醛酸（生物試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甘露醇（鄭州百合化工產(chǎn)品有限公司）；硫酸為高純試劑，無水吡啶、六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷、碳酸鋇（BaCO3）、無水乙醇均為分析純。

2 方法

2.1 KPS的制備

精密稱取大葉南五味子100 g，利用水提醇沉法提取多糖[12]，經(jīng)三氯乙酸脫蛋白、活性炭脫色純化[13]后得到KPS，備用。

2.2 多糖的水解

精密稱取KPS 50.0mg，置于安瓿中，加入2moL·L－1硫酸溶液5m L，酒精噴燈真空封管，置于烘箱里以110℃水解8 h，取出冷卻至室溫后加入BaCO3粉末，靜置過夜，待中和至中性，以10 000 r·min－1離心5min除去沉淀，取上清液，冷凍干燥后得到多糖水解產(chǎn)物，備用[14]。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)單糖硅烷化衍生

分別稱取9種標(biāo)準(zhǔn)單糖各5.0mg、內(nèi)標(biāo)物甘露醇2.0mg，60℃干燥至恒重，加入無水吡啶1m L，75℃溶解30m in，再加入0.6m L硅烷化試劑（六甲基二硅胺烷∶三甲基氯硅烷＝2∶1），搖勻[14]，60℃反應(yīng)10m in，10 000 r·m in－1離心10m in后，取上清液，備用。

2.4 色譜條件

色譜柱：SE-30彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25 μm）；檢測器：FID；柱溫：195℃；進(jìn)樣口溫度：220℃；檢測器溫度：230℃；分流比：80∶1；載氣：高純氮氣，流速：30m L·m in－1；進(jìn)樣量：1.0μL。

2.5 多糖衍生物的制備

稱取10.0mg徹底干燥的水解產(chǎn)物與2.0mg甘露醇，按“2.3”項下方法衍生化，10 000 r·m in－1離心5m in后取上清液進(jìn)行GC分析。以內(nèi)標(biāo)法定性分析KPS的化學(xué)組成。

2.6 相對校正因子和摩爾比的測定

2.6.1 相對校正因子 相對校正因子的計算公式為f＝（Wi×As）/（Ws×Ai）。式中，Wi為標(biāo)準(zhǔn)單糖的質(zhì)量；Ws為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量；Ai為標(biāo)準(zhǔn)單糖的峰面積；As為內(nèi)標(biāo)物的峰面積[15]。

2.6.2 摩爾比 根據(jù)下列公式求得各單糖的摩爾數(shù)，即N＝（Ax×Mr）/（As×f）。式中，N為單糖的物質(zhì)的量；Ax為單糖的峰面積；As為內(nèi)標(biāo)物的峰面積；f為該單糖的校正因子；Mr為該單糖的分子量[15]。進(jìn)而求得多糖水解產(chǎn)物中的單糖摩爾比。

3 結(jié)果與分析

3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物GC分析

混合標(biāo)準(zhǔn)單糖中各單糖的定性是通過與每個單糖的保留時間作對比確定的?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的GC圖見圖1；各標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時間見表1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的GC圖Fig 1 GC chromatogram of m ixed standard monosaccharides derivative

表1 各標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時間（m in）Tab 1 Retention timeof standardmonosaccharides（m in）

由圖1可知，采用硅烷化衍生法，只有葡萄糖和甘露糖對應(yīng)一種衍生化產(chǎn)物，其他單糖則對應(yīng)多個衍生物；各單糖與內(nèi)標(biāo)物能完全分開。在上述GC條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)單糖中各種單糖衍生物均可以得到較好的分離。

3.2 KPS水解衍生化產(chǎn)物GC分析

在與混合標(biāo)準(zhǔn)單糖同樣的反應(yīng)和測定條件下，進(jìn)行KPS水解產(chǎn)物硅烷化衍生物的毛細(xì)管GC分析。將樣品的混合單糖衍生物色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物色譜峰經(jīng)GC-solution軟件比對，鑒定相應(yīng)單糖的色譜峰，詳見圖2。

圖2 KPS水解衍生化產(chǎn)物的GC圖Fig 2 GC chromatogram sof hydrogen derivative from KPS

由圖2可知，從大葉南五味子果實中獲得的KPS含有甘露糖、木糖、半乳糖、果糖、葡萄糖和半乳糖醛酸；保留時間分別為12.730、14.723、15.264m in的峰為未知物峰。

3.3 KPS中單糖摩爾比的計算

根據(jù)單糖和內(nèi)標(biāo)物的峰面積，按照公式分別計算各種單糖標(biāo)準(zhǔn)品相對于內(nèi)標(biāo)物的校正因子。以KPS中各種單糖及內(nèi)標(biāo)的峰面積和單糖各自的校正因子來計算KPS中各種單糖的摩爾比。經(jīng)過計算，得到KPS中已確定的6種單糖——甘露糖、木糖、半乳糖、果糖、葡萄糖和半乳糖醛酸的摩爾比為19.78∶2.75∶0.149∶1∶0.381∶0.127。

4 討論

糖類衍生化后進(jìn)行GC分析有多種方法，其中糖腈乙酸酯衍生物GC法具有衍生物制備簡便、試劑易得等優(yōu)點，而且每種單糖得到單一的色譜峰，這一點對未知結(jié)構(gòu)多糖的分析是十分重要的。

分析多糖中的單糖組成，首要工作就是將多糖樣品進(jìn)行徹底的水解。因為如果水解效果不理想，多糖很難完全水解為單糖或者僅僅有很少部分水解，會導(dǎo)致樣品水解衍生化產(chǎn)物在GC分析中峰值很小，從而影響多糖中含量較少的單糖的測定。通過對影響水解效果的各種因素的考察分析，筆者認(rèn)為對于KPS的水解采用2moL·L－1硫酸溶液水解8 h較為合適。用BaCO3中和處理時借助超聲波能極大縮短中和時間，減少BaCO3的消耗，離心除去沉淀可防止對樣品的損耗。三氟乙酸（TFA）也可用于多糖的水解，但因其具有揮發(fā)性、腐蝕性，故本試驗未選擇TFA水解KPS。

筆者曾經(jīng)對比了SE-30不銹鋼柱和SE-30毛細(xì)管柱對單糖的分離效果，發(fā)現(xiàn)SE-30毛細(xì)管柱的分離效果較好，信號值高，且無需程序升溫亦可使各種單糖較好的分離、測定。由于毛細(xì)管GC進(jìn)樣量少，容易帶來體積誤差，故筆者采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行分析測定，可以校正吸量誤差并保留時間的重現(xiàn)性，使結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠。

由于自然界中存在的單糖種類較多，有些單糖很難得到標(biāo)準(zhǔn)品，因此本試驗只能確定出KPS中含有的6種單糖。圖2中的另外3個峰可能為未知單糖或其他雜質(zhì)，尚需進(jìn)一步確證；但從GC分析結(jié)果來看，鼠李糖、阿拉伯糖和木糖等五碳糖比甘露糖和葡萄糖等六碳糖早出峰，因此可以推測未知3個峰如果是單糖則可能為五碳糖。

綜上，該方法簡便、靈敏，可以準(zhǔn)確測定出南五味子多糖中含有的各種單糖。

[1] 苗明三.五味子多糖對衰老模型小鼠的影響[J].中國醫(yī)藥學(xué)報，2002，17（3）：187.

[2] 穆衛(wèi)東，王 虹，史 影，等.南北五味子多糖的提取及清除自由基作用的對比分析[J].光譜實驗室，2011，28（1）：95.

[3] 陳榮華.五味子醇提藥渣中粗多糖的提取及生物活性研究[D].鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)，2008.

[4] 于 赫，李 冀，王艷杰.五味子多糖對H22荷瘤小鼠血清IL-2、IL-10和VEGF表達(dá)的干預(yù)作用研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2010，38（2）：39.

[5] 仰榴青，陳榮華，吳向陽，等.五味子醇提殘渣中粗多糖的免疫活性研究[J].食品科學(xué)，2008，29（6）：392.

[6] 王會堂，侯 影，葉立娜，等.五味子多糖提取物的降血脂功能試驗[J].長春理工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，32（4）：622.

[7] 劉丹娜，羅 晶.不同劑量五味子多糖灌胃給藥鎮(zhèn)痛作用的觀察[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，29（12）：1 115.

[8]Leung MY，F(xiàn)ung KP，Choy YM.The isolation an characterization of an immunomodulatory and anti-tumopolysaccharide preparation fromFlammulina velutipes[J].Immunopharmacology，1997，35（3）：255.

[9] Yoshida T.Synthesisof polysaccharideshaving specific biologicalactivities[J].Prog Polym Sci，2001，26（3）：379.

[10] 李 輝，羅佳波.苯酚-硫酸法測定圍樂顆粒中總多糖的含量[J].中國藥房，2008，19（9）：685.

[11] 王宏軍，蔣 紅，鄧旭明.貴州南五味子多糖對雞細(xì)胞免疫和體液免疫的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2011，31（6）：884.

[12] 蔣 紅，王宏軍，李繼昌，等.大葉南五味子中水溶性多糖提取工藝條件的優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，43（6）：84.

[13] 王宏軍.南五味子多糖提取及其對雛雞免疫活性的研究[D].長春：吉林大學(xué)，2011.

[14] 劉春蘭，鄧義紅，杜 寧，等.新疆雪蓮水溶性多糖的分離純化及組成分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21（1）：99.

[15] 楊豐熔，蘇 強，李瑞艷，等.黨參多糖的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8（17）：34.

Analysis of M onosaccharides Com position in Polysaccharide fromKasura marmorataby Capillary Gas Chromatography

YAO Dan，WANG Hong-jun，YANG Jia-yu，LEIM ing-sheng（Liaoning Medical University，Liaoning Jinzhou 121001，China）

OBJECTIVE：To study the types and proportion of monosaccharides inKasura marmoratapolysaccharide.METHODS：K.marmoratapolysaccharide was hydrolyzed w ith 2 moL·L－1sulfuric acid.The dried hydroxlyslate was dissolved in pyridine，and derived by silane.Themonosaccharides inK.marmoratapolysaccharide were determ ined by capillary GC.The determ ination was performed on SE-30（30 m×0.25 mm×0.25μm）capillary column.Injection and detector temperature was 220℃ and 230℃ respectively.The column temperature was 195℃.RESULTS：K.marmoratapolysaccharide made up of six monosaccharides，such as mannos，exylose，galactose，fructose，glucose，galacturonic acid.The mole proportion of mannose-xylose-galactose-fructose-glucose-galacturonic acid was 19.78∶2.75∶0.149∶1∶0.381∶0.127.CONCLUSION：Themethod reported in this paper is simple and sensitive，which can be used for determ ination ofmonosaccharides composition inK.marmoratapolysaccharide.

Capillary gas chromatography；Kadsuramarmorata；Polysaccharide；Monosaccharides composition

R284.1；R917

A

1001-0408（2012）23-2158-03

2011-12-12

2012-02-05）