基于反義RNA技術(shù)的FabI抑制劑篩選模型的構(gòu)建

殷瑜，戈梅，錢秀萍，陳代杰

基于反義RNA技術(shù)的FabI抑制劑篩選模型的構(gòu)建

殷瑜，戈梅，錢秀萍，陳代杰

目的基于反義 RNA 沉默技術(shù)構(gòu)建針對(duì)細(xì)菌 FabI 的超敏全細(xì)胞篩選模型，用于篩選 FabI 抑制劑。

方法以Escherichia coli基因組 DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增fabI基因的 -74 ～ 86 bp 核苷酸序列，反向插入攜帶 paired termini 結(jié)構(gòu)的反義質(zhì)粒 pHN678 中，得到重組質(zhì)粒pHNF，再轉(zhuǎn)化至E.coli中，得到反義工程菌E.coli/pHNF；通過(guò)平板表型觀察對(duì)反義工程菌進(jìn)行篩選；考察了 IPTG濃度對(duì)篩選模型的影響，確定 96 孔板抗菌篩選模型的條件，并用三氯生作為陽(yáng)性對(duì)照、氨芐西林和淺藍(lán)菌素作為陰性對(duì)照對(duì)該模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

結(jié)果獲得了針對(duì)fabI的反義工程菌，確定了最適 IPTG濃度為 40 μmol/L，成功構(gòu)建了 FabI 特異性酶抑制劑的超敏全細(xì)胞篩選模型，并驗(yàn)證了其可行性。應(yīng)用該篩選模型對(duì)5847 個(gè)內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行活性篩選，初篩陽(yáng)性率約為 9.7%，經(jīng)復(fù)篩后獲得 8 份陽(yáng)性樣品。

結(jié)論成功建立了基于反義 RNA 沉默技術(shù)的 FabI 超敏全細(xì)胞篩選模型，并利用該模型篩選到 8 份陽(yáng)性樣品。

RNA，反義； 藥物評(píng)價(jià)，臨床前； 烯脂酰-ACP 還原酶

反義 RNA 技術(shù)可以在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平沉默靶基因，選擇性控制靶基因的蛋白表達(dá)量，從而使所構(gòu)建反義菌株對(duì)外界特異性抑制劑非常敏感。該技術(shù)已經(jīng)成功用于抗菌藥物篩選模型的構(gòu)建，并篩選獲得了能夠有效抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐萬(wàn)古霉素腸球菌（VRE）的平板霉素[6-7]。本文應(yīng)用反義 RNA 技術(shù)構(gòu)建針對(duì) FabI的反義Escherichi coli工程菌，以此構(gòu)建靶向 FabI的全細(xì)胞篩選模型，并將該模型用于篩選植物內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物的活性組分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及連接酶E.coliDH5α、E.coliBL21、E.coliTOP10 菌株由本實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒pHN678（攜帶 paired termini 結(jié)構(gòu)）由英國(guó)皇家獸醫(yī)學(xué)院 Liam Good 實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送；PCR 產(chǎn)物純化和凝膠回收試劑盒購(gòu)于杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)公司；T4 DNA 連接酶、PrimeStar HS DNA 聚合酶和各類內(nèi)切酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 儀器 680 型酶標(biāo)儀為美國(guó) Bio-Rad 公司產(chǎn)品；棱光 UV762 紫外/可見分光光度計(jì)為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 工程菌的構(gòu)建及驗(yàn)證

1.2.1.1 反義工程菌的構(gòu)建 根據(jù)E.coliBL21（DE3）基因組（Gene-Bank號(hào)：NC012947）設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增as-fabI片段的引物，由上海生工生物工程公司合成。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定、純化后重組至pHN678 中獲得重組質(zhì)粒 pHNF，轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli/TOP10 感受態(tài)細(xì)胞中，再通過(guò)質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。

重組質(zhì)粒和空白質(zhì)粒 pHN678 分別轉(zhuǎn)化E.coli，獲得相應(yīng)反義工程菌株E.coli/pHNF 及對(duì)照菌E.coli/pHN678。反義引物：as-fabI正向：CCG GAGCTC（XhoI）TTCGTACTGTTTACTAAAAC；as-fabI反向：TAATCCATGG（NcoI）TGCATCGCC TGAGCGATACC。PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃ 預(yù)變性2 min；94 ℃、2 min，共 30 次循環(huán)變性；51.5 ℃30 s；72 ℃ 30 s；72 ℃ 延伸 4 min。

1.2.1.2 反義工程菌的篩選 采用平板表型觀察法，陽(yáng)性菌在含誘導(dǎo)劑 IPTG 的平板上生長(zhǎng)受抑制。將單菌落挑至液體 LB 培養(yǎng)基中，37 ℃ 過(guò)夜培養(yǎng)后，對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，以攜帶空白質(zhì)粒pHN678 的菌株作為對(duì)照，取 10 μl 點(diǎn)種于含有一定濃度 IPTG 及 30 μg/ml 氯霉素的平板上過(guò)夜培養(yǎng)。以經(jīng)低濃度 IPTG 誘導(dǎo)、生長(zhǎng)最易受抑制的菌落為最適工程菌。

1.2.2 FabI 抑制劑液體篩選模型的建立 在兩塊無(wú)菌 96 孔板各孔中分別加入OD630值為 0.1 的初始菌濃、氯霉素濃度為 30 μg/ml、IPTG 濃度分別為 0、5、10、20、30、40、50、60 μmol/L 的 LB液體菌（反義工程菌株E.coli/pHNF 及對(duì)照菌E.coli/pHN678）懸液 150 μl，于 37 ℃、100 r/min 條件下振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD630，分析數(shù)據(jù)，選取影響反義菌株生長(zhǎng)的 IPTG 臨界濃度為篩選模型濃度。

1.2.3 模型評(píng)價(jià) 以 0.5、2.5、5.0 μg/ml 的氨芐西林和 15、22.5、30 μg/ml 的淺藍(lán)菌素為陰性對(duì)照，以 25、37.5、50 μg/ml 三氯生為陽(yáng)性對(duì)照評(píng)價(jià)該篩選模型的有效性，每隔 1 h 測(cè)定OD630值。每個(gè)濃度重復(fù) 3 次。

1.2.4 樣品活性篩選流程 在 1.2.2 模型建立的基礎(chǔ)上將 100 μg/ml 的待測(cè)樣品加入不同濃度IPTG 菌懸液的 96 孔板培養(yǎng)孔中，37 ℃、100 r/min條件下振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD630，以如下公式計(jì)算抑制率。

2 結(jié)果

2.1 反義工程菌的構(gòu)建及篩選

2.1.1 反義質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證 如圖 1所示，通過(guò) PCR 方法擴(kuò)增得到的產(chǎn)物大小為 179 bp，與所選擇的基因長(zhǎng)度（包含引物中的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基）相符。

圖 1 fabI 基因 -75 ～ 86 bp 序列的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 PCR product of fabI -75 ～ 86 bp

PCR 產(chǎn)物與 pHN678 連接獲得重組質(zhì)粒pHNF，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 后經(jīng)酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖 2，說(shuō)明fabI基因的 -75 ～ 86 bp 序列以正確的方向插入到 pHN678 中。

圖 2 重組質(zhì)粒 pHNF 的雙酶切鑒定Figure 2 Enzymatic identification of pHNF

圖 3 E.coli DH5α/pHNF、E.coli TOP10/pHNF 和 E.coli BL21/pHNF 的表型觀察結(jié)果（678：E.coli/pHN678；F：E.coli/pHNF；D：E.coli DH5α；B：E.coli BL21；T：E.coli TOP10）Figure 3 Phenotype of E.coli DH5α/pHNF, E.coli TOP10/pHNF and E.coli BL21/pHNF (678 and F indicate E.coli/pHN678 and E.coli/pHNF, respectively.D: E.coli DH5α; B: E.coli BL21; T: E.coli TOP10)

表 1 IPTG 濃度對(duì) E.coli TOP10/pHN678 和 E.coli TOP10/pHNF 生長(zhǎng)的影響Table 1 Effect of IPTG on the growth of E.coli TOP10/pHN678 and E.coli TOP10/pHNF

圖 4 氨芐西林對(duì) E.coli TOP10/pHN678（A）和 E.coli TOP10/pHNF（B）生長(zhǎng)曲線的影響Figure 4 Effect of ampicilin on the growth curve of E.coli TOP10/pHN678 (A) and E.coli TOP10/pHNF (B)

2.1.2 宿主的選擇 選擇E.coliDH5α、E.coliTOP10、E.coliBL21 作為宿主，考察各反義工程菌的敏感性。結(jié)果（圖 3）表明在接種量、IPTG 濃度一定時(shí)，E.coliTOP10/pHNF 更容易受抑制。因此，選擇E.coliTOP10/pHNF 用于后續(xù)抗菌篩選模型的構(gòu)建。

2.2 FabI 抑制劑液體篩選模型條件的確立

由表 1 看出，40 μmol/L 為 IPTG 的臨界濃度。當(dāng) IPTG 濃度低于該濃度時(shí)，工程菌E.coliTOP10/pHNF 與對(duì)照菌E.coliTOP10/pHN678 兩者OD值相近。高于 40 μmol/L 時(shí)，工程菌的OD值低于對(duì)照菌，且隨著 IPTG 濃度升高差距越明顯。

因此，確立篩選模型條件為：96 孔酶標(biāo)板各孔加入含有 30 μg/ml 氯霉素、40 μmol/L IPTG 的LB 液體培養(yǎng)基 150 μl，初始菌濃OD630為 0.1。加入一定濃度的待測(cè)樣品后，37 ℃，100 r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。比較同一樣品對(duì)應(yīng)的對(duì)照孔（含對(duì)照菌）和測(cè)試孔（含反義工程菌）的OD630值，測(cè)試孔的OD值低于對(duì)照孔的為陽(yáng)性結(jié)果孔。

2.3 FabI 抑制劑篩選模型的驗(yàn)證

選用氨芐西林（常規(guī)細(xì)菌抑菌劑）和淺藍(lán)菌素（細(xì)菌 FabF/FabH 抑菌劑）作為陰性對(duì)照，三氯生作為陽(yáng)性對(duì)照，驗(yàn)證上述模型條件的可行性。

圖 5 淺藍(lán)菌素對(duì) E.coli TOP10/pHN678（A）和 E.coli TOP10/pHNF（B）生長(zhǎng)曲線的影響Figure 5 Effect of cerulenin on the growth curve of E.coli TOP10/pHN678 (A) and E.coli TOP10/pHNF (B)

圖 6 三氯生對(duì) E.coli TOP10/pHN678（A）和 E.coli TOP10/pHNF（B）生長(zhǎng)曲線的影響Figure 6 Effect of tricloson on the growth curve of E.coli TOP10/pHN678 (A) and E.coli TOP10/pHNF (B)

由陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，工程菌和對(duì)照菌隨氨芐西林和淺藍(lán)菌素濃度變化呈現(xiàn)相同的抑制趨勢(shì)（圖 4 和圖5），而陽(yáng)性對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)三氯生濃度低于 25 μg/ml 時(shí)，兩株菌株均未被抑制；而增至 37.5 μg/ml 及 50 μg/ml 時(shí)，兩株菌均出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，且工程菌的被抑制程度明顯高于對(duì)照菌（圖 6）。說(shuō)明該篩選模型的特異性及靈敏度較高，達(dá)到理想要求。

2.4 樣品的活性篩選結(jié)果

2.4.1 樣品初篩 將實(shí)驗(yàn)室化合物庫(kù)保藏的5847 份植物內(nèi)生真菌發(fā)酵凍干樣品應(yīng)用于 FabI抗菌藥物篩選模型上進(jìn)行篩選，獲得了 559 份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為 9.7%。

2.4.2 樣品復(fù)篩 從 559 份初篩陽(yáng)性樣品的對(duì)應(yīng)產(chǎn)生菌株中挑選了 60 株重新發(fā)酵制備樣品，應(yīng)用模型篩選方法進(jìn)行復(fù)篩，得到 8 份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為 13.3%。

3 討論

自然界中微生物的多樣性及其代謝產(chǎn)物的多樣性，提供了發(fā)現(xiàn)新藥以及先導(dǎo)化合物的不竭動(dòng)力。但隨著從微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中獲得的抗生素的大量問(wèn)世，應(yīng)用常規(guī)抗生素篩選模型，從自然界篩選和發(fā)現(xiàn)新藥變得越來(lái)越困難[8]，而應(yīng)用反義技術(shù)發(fā)現(xiàn)的新型抗生素—平板霉素為解決抗菌藥物篩選問(wèn)題帶來(lái)了曙光[6-7]。本研究中我們應(yīng)用反義RNA 技術(shù)建立了以 FabI 為靶點(diǎn)的超敏全細(xì)胞藥物篩選模型，初篩獲得了 559 份陽(yáng)性樣品，但對(duì)其中的 60 份樣品復(fù)篩后僅獲得了 8 份陽(yáng)性樣品，這可能是復(fù)篩所用樣品為再發(fā)酵樣品，再發(fā)酵過(guò)程中植物內(nèi)生菌的易退化性導(dǎo)致了發(fā)酵樣品的活性丟失。期望能夠通過(guò)化合物分離純化的方法，獲得針對(duì) FabI 的靶標(biāo)明確、細(xì)胞滲透性強(qiáng)、毒性小的活性化合物。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(3):197-201

Establishment of screening model for FabI inhibitors based on antisense RNA technology

YIN Yu, GE Mei, QIAN Xiu-ping, CHEN Dai-jie

ObjectiveTo establish a highly sensitive whole-cell screening model targeting FabI based on antisense RNA silencing technology for FabI inhibitors screening.

MethodsIn order to improve silencing effect, vector with paired termini was utilized.Transformants were identified by phenotype screening on solid plates.Effect of IPTG concentration was studied and the optimal screening parameters were determined.Triclosan and ampicillin were used as positive and negative control to evaluate the feasibility of this screening model, respectively.

ResultsFabI antisense strain was obtained.The optimal concentration of IPTG was 40 μmol/L.The highly sensitive whole-cell FabI specific inhibitor screening model was established and evaluated.5847 fermentation samples from endophytic fungi were screened and the positive rate was about 9.7%.Eight active samples were gained in secondary screening.

Conclusion One highly sensitive whole-cell FabI specific inhibitor screening model was established based on antisense RNA technology and eight active samples were gained.

RNA, antisense; Drug evaluation, preclinical; FabI

CHEN Dai-jie, Email: hccb001@163.com

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2012, 7(3):197-201

隨著抗生素的濫用，臨床致病菌的耐藥性問(wèn)題也日趨嚴(yán)重[1]。研究新的抗菌靶點(diǎn)、并基于此建立新的篩選模型成為發(fā)現(xiàn)抗耐藥菌新藥的重要途徑。脂肪酸是細(xì)胞生物膜等的重要組成成分，而細(xì)菌和人類的脂肪酸合成分屬于兩種途徑，前者進(jìn)行的是II 型脂肪酸合成途徑，而后者則屬于 I 型，這一差別使得細(xì)菌脂肪酸合成酶系成了當(dāng)今新型抗菌藥物篩選的靶位之一[2-4]。烯脂酰-ACP 還原酶（FabI）是大部分細(xì)菌脂肪酸合成所必需的酶，是一種由fabI基因編碼的 NADH 或 NADPH 依賴型單功能酶，而真核細(xì)胞中沒(méi)有此酶，它已逐漸成為抗菌藥物研究的熱點(diǎn)靶位。傳統(tǒng)的 FabI 抑制劑是二氯苯氧氯酚（三氯生），已被廣泛應(yīng)用于肥皂、牙膏等日用化學(xué)品之中[5]。但到目前為止，還

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.007

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2009ZX09302-004）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81102355）

200240 上海交通大學(xué)藥學(xué)院（殷瑜、錢秀萍、陳代杰）；200240 上海來(lái)益生物藥物研發(fā)中心（殷瑜、戈梅）；200040 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院（陳代杰）

陳代杰，Email：hccb001@163.com

2012-03-29沒(méi)有細(xì)菌脂肪酸生物合成酶 FabI 抑制劑在臨床上得到應(yīng)用。因此，尋找化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、特異性強(qiáng)、低毒高效的抗菌新藥 FabI 抑制劑，仍然是藥物研究工作者重要的研究領(lǐng)域。

Author Affiliations: School of Pharmacy, Shanghai Jiaotong University, 200240 Shanghai, China (YIN Yu, QIAN Xiu-ping, CHEN Dai-jie); Shanghai Laiyi Biological Drug Research and Development Center Co.Ltd., 200240 Shanghai, China (YIN Yu, GE Mei);Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, 200040 Shanghai, China (CHEN Dai-jie)

·論著·