L-谷氨酸-5-甲酯金屬銅化合物的合成、表征及生物活性

金龍飛，范 昕，金呈之，王彥榮，吳勇飛，吳臘梅

(中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，武漢430074)

L-谷氨酸類的金屬配合物因其配位后具有復(fù)雜的共軛結(jié)構(gòu)，與生物環(huán)境相似，目前對其金屬配合物的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)［1-3］.文獻(xiàn)［4］合成出金屬鉬與L-谷氨酸鹽金屬配合物，并對其晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究.但關(guān)于L-谷氨酸-5-甲酯的金屬配合物與生物活性的研究尚少.筆者在本室L-谷氨酸-5-甲酯金屬鎂和鈣配合物研究的基礎(chǔ)上［5］，成功合成出L-谷氨酸-5-甲酯金屬銅配合物，并對其晶體結(jié)構(gòu)、三磷酸腺苷分解的生物活性和抗菌活性進(jìn)行了系統(tǒng)的測定和分析，為進(jìn)一步深入研究L-谷氨酸-5-甲酯與不同金屬進(jìn)行配位后配合物的生物活性提供一定的參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

元素分析儀(Per kin Elmer 2400 CHN型，德國);高分辨傅立葉紅外光譜儀(FT-IR NEXUS智能型，KBr壓片，美國Nicolet公司);可見紫外分光光度計(jì)(UV-265型，日平島津);數(shù)字熔點(diǎn)儀(X-4型，25℃，190～700 nm，北京泰克儀器有限公司);CCD X-射線單晶銜射儀(Bruker SMART APEX型，德國).

L-谷氨酸為生物試劑;無水甲醇、硫酸、三乙胺、乙酸銅，均為分析純，使用前未進(jìn)一步提純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 L-谷氨酸-5-甲酯的合成

L-谷氨酸-5-甲酯參照文獻(xiàn)［6］合成.取 L-谷氨酸7.50 g(0.05 mol)置于燒瓶中，加入無水甲醇120 mL，邊攪拌邊加入98%濃 H2SO43.70 mL，25℃下反應(yīng)4～5 h.用三乙胺的甲醇溶液(V(醇)∶V(胺)=2∶1)調(diào)節(jié)至pH=8.0，置冰箱中過夜.次日抽濾出固體，用95%甲醇進(jìn)行重結(jié)晶，用無水甲醇洗滌.常溫下真空干燥至恒重，純品為白色晶狀固體.產(chǎn)率93.8%.Tm.p.=169～170℃.元素分析，測試:C，45.02;H，6.89;N，8.71%. 計(jì)算(C6H11NO4):C，44.72;H，6.88;N，8.69%.FT-IR(KBr pellet，υ/cm-1):3130 ～ 2598 m，1730 s，1611 s，1583 s，1355 m，1080 m.

1.2.2 L-谷氨酸-5-甲酯合銅(Cu(C6H10NO4)2)的合成

將0.32 g(2.00 mmol)L-谷氨酸-5-甲酯溶于15 mL水中，在室溫下攪拌使其完全溶解，緩慢滴加溶有0.21 g(1.05 mmol)Cu(CH3COO)2·H2O的5 mL水溶液，溶液中出現(xiàn)藍(lán)色沉淀.繼續(xù)反應(yīng)30 min，過濾藍(lán)色沉淀物，用蒸餾水洗滌，真空干燥至恒重.純品為藍(lán)色晶狀固體.在合成過程中，當(dāng)溶液中出現(xiàn)藍(lán)色晶體沉淀時(shí)，可以挑選出適合測試的單晶.產(chǎn)率:89.0%.Tm.p.＞300℃.元素分析，測試:C，37.70;H，5.28;N，7.40%.計(jì)算(C12H20Cu N2O8):C，37.55;H，5.25;N，7.30%.FI-IR(KBr壓片，υ/cm-1):1732 s，1617 s，1574 s，1329 m，1046 m，566m，475 m.

1.2.3 (Cu(C6H10NO4)2)晶體結(jié)構(gòu)的測定

取0.30 mm×0.20 mm×0.06 mm的藍(lán)色晶體置X-射線單晶衍射儀上，在293(2)K，采用石墨單色化的MoKa射線 (λ =0.710 73?)作為衍射光源，掃描方式為φ和ω，在2.15≤θ≤25.99收集得到6 037個(gè)衍射點(diǎn)，其中2 841個(gè)為獨(dú)立點(diǎn)，Rint=0.0568.所有數(shù)據(jù)均采用SADABSmulti-scan校正程序進(jìn)行校正［7，8］，其中，對滿足I＞ 2σ(I) 的 2841個(gè)點(diǎn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析.晶體結(jié)構(gòu)用直接法解得.對所有非氫原子坐標(biāo)，使用全距陣最小二乘法進(jìn)行各項(xiàng)異性溫度因子修正［8-10］.對與N和C原子鍵合的H原子，采用騎跨式理論加氫.最終精修結(jié)果為:R1=0.0421，wR2=0.1028(見表1).

表1 (Cu(C6 H10 NO4)2)晶體學(xué)數(shù)據(jù)Tab.1 Crystallographic data of Cu(C6H10 NO4)2

1.2.4 催化三磷酸腺苷二鈉水解的活性測試

催化三磷酸腺苷二鈉水解的效果(活力大小)可用反應(yīng)終止后反應(yīng)液中無機(jī)磷(Pi)的含量確定［11，12］.而無機(jī)磷可與硫酸鉬酸銨反應(yīng)生成有色化合物，因此無機(jī)磷含量可用比色法測定.

無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:在均加入了0.1 mL 20%三氯乙酸(TCA)、0.3 mL H2O的7支編號試管中分別加入 0.1 mL 的 0，10，20，30，40，50，60 mmol/L的Na2HPO3，再于各試管中加入2.5 mL硫酸鉬酸銨-硫酸亞鐵溶液，搖勻并測定OD660.測量5次/樣品.以O(shè)D660為縱坐標(biāo)，Pi濃度為橫坐標(biāo)繪制無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線.

(Cu(C6H10NO4)2)對三磷酸腺苷二鈉的水解活性測定:通過測定混合體系的OD值，由無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的無機(jī)磷含量值，即可判斷出活性影響.具體操作為:分別取反應(yīng)介質(zhì)溶液0.4 mL于2支試管中，其中，一支試管中依次加入0.4 mL化合物溶液和1.0 mL溶劑，另一支試管中直接加入1.4 mL溶劑(作為參照液).室溫下反應(yīng)5 min后于2支試管中分別加入0.2 mL 20%TCA中止反應(yīng).吸取上述反應(yīng)液各0.5 mL，再各加入2.5 mL硫酸鉬酸銨-硫酸亞鐵溶液.以參照液為對照，測定A660.其中反應(yīng)液分別按下比例配制:

①反應(yīng)介質(zhì)溶液:50 mmol/L三羥基氨基甲烷(Tris)-HCl(pH=8.80)+5 mmol/L三磷酸腺苷二鈉+20 mmol/L NaCl+100 mmol/L CH3OH;

②質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硫酸鉬酸銨溶液:10 g鉬酸銨 +100 mL 5 mol/L硫酸;

③硫酸鉬酸銨-硫酸亞鐵溶液:5 g硫酸亞鐵 +10 mL 10%硫酸鉬酸銨溶液+87.5 mL蒸餾水;

④待測目標(biāo)化合物溶液配制:將待測目標(biāo)化合物配成質(zhì)量濃度約16 g/L溶液.

1.2.5 抗菌活性測試

化合物的抗菌活性測試，采用最小抑制濃度法(MIC).即在一定濃度梯度的化合物溶液中，加入菌種和培養(yǎng)基，讓菌類在其中生長繁殖.通過觀測溶液渾濁時(shí)對應(yīng)的溶液濃度，即可得到最小抑制濃度值.

測試菌種為金黃色葡萄糖球菌(Staphylococcus aureus，Gram+)、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli，Gram-)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis，Gram+)和普通變形桿菌(Proteus vulgaris，Gram-).培養(yǎng)基為Mueller-Hinton broth.L-谷氨酸-5-甲酯合銅溶液的以蒸餾水配成濃度分別為 1600，800，400，200，100，50，25μg/mL.溶劑水不呈現(xiàn)抗菌活性.

2 結(jié)果與討論

2.1 合成和結(jié)構(gòu)的光譜分析

(Cu(C6H10NO4)2)的合成采用了自組裝條件，直接在相應(yīng)的水溶液中制備得到.所得化合物易溶于水.元素分析的測量結(jié)果與理論計(jì)算結(jié)果相符.

(Cu(C6H10NO4)2)的紅外光譜中，1732 cm-1處的強(qiáng)吸收峰，可指定為酯基中υas(C=O)特征吸收峰［13］.1617 cm-1處為 υas(COO-) 吸收峰，1329 cm-1為υs(COO-)吸收峰;與L-谷氨酸-5-甲酯中υas(COO-)、υs(COO-)譜峰相比［5］，均發(fā)生了移動(dòng)，表明羧基與金屬銅離子的成鍵.比較υas(COO-)、υs(COO-)譜峰，Δυ(COO-)=288 cm-1，因此可認(rèn)為化合物中羧基是以單齒配位模式與金屬離子成鍵的［14-16］.1046 cm-1處有 υ(C ― N)伸縮振動(dòng)，與 L-谷氨酸-5-甲酯中 υ(C― N)伸縮振動(dòng)相差 34 cm-1［5］;同時(shí)未見 υas(NH+3)、υs(NH+3)、δas(NH+3)及δs(NH+3)吸收峰，說明氨基中氮原子也參加了成鍵.此外，可認(rèn)為566 cm-1和475 cm-1處的吸收峰分別為υ(N―Cu)和υ(O―Cu)伸縮振動(dòng)［17］.

2.2 晶體結(jié)構(gòu)分析

(Cu(C6H10NO4)2)的晶體屬單斜晶系、P2(1)空間群，a=9.5883(19) ?、b=5.1521(10) ?、c=15.562(3)?、β =98.65(3)°.其獨(dú)立單元結(jié)構(gòu)圖和晶胞堆積圖分別見圖1和圖2，主要的鍵長和鍵角見表2和表3.

圖1 L-谷氨酸-5-甲酯合銅的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of copper complex of 5-methyl-L-glutamate

圖2 (Cu(C6 H10 NO4)2)晶胞堆積圖Fig.2 Packing diagram of copper complex of5-methyl-L-glutamate

表2 (Cu(C6 H10 NO4)2)中選擇的部分鍵長Tab.2 Selected bond lengths of 5-methyl-L-glutamate

表3 (Cu(C6 H10 NO4)2)中選擇的部分鍵角Tab.3 Selected bond angle(°)of 5-methyl-L-glutamate

(Cu(C6H10NO4)2)為單核四配位結(jié)構(gòu)，每分子中含有2個(gè) L-谷氨酸-5-甲酯配體.L-谷氨酸-5-甲酯配體通過羧羥基氧原子和氨基氮原子參加配位，形成一個(gè)“鉗狀”的平面構(gòu)型［18］.配合物中心為CuN2O2，為平面四邊形，其 O5—Cu1—O1和 N1—Cu1—N2鍵角分別為178.85(16)°和176.62(17)°，三個(gè)原子的連線近乎形成一條理想的直線.而O5—Cu1—N1、O1—Cu1—N1、O5—Cu1—N2 和 O1—Cu1—N2鍵角分別為94.79(15) °、84.23(13) °、84.77(14)°和96.24(15)°，這些角度與理想的正四邊形90°稍有偏離，是由于與中心金屬離子Cu(II)配位的氧原子和氮原子為2類不同的原子.配合物中的O2—C1—O1和O6—C7—O5鍵角分別為123.7(4)°和123.5(4)°，與配體中的鍵角125.9(3)°(O2—C1—O1)相比稍有減小，這與O1和O5原子參加了配位有關(guān);而N1—C2—C1和N2—C8—C7鍵角分別為106.6(3)°和109.0(3)°，這與配體中的鍵角108.7(2)°(N1—C2—C1)相比變化不大.(Cu(C6H10NO4)2)中的 Cu—O鍵長1.944～1.947?和 Cu—N鍵長1.980?均為正常，與其它文獻(xiàn)［19-20］中四配位銅的鍵長基本吻合.其中C1—O2、C1—O1、C7—O6 和 C7—O5鍵長分別為1.239(5)，1.282(5)，1.231(5)，和1.274(5)?，與配體中的鍵長1.253(4)?(C1—O2)和1.252(6)?(C1—O1)相比明顯變長，這是因?yàn)轸然兄挥幸粋€(gè)氧原子O1或O5參與配位，當(dāng)氧原子配位后電子云偏向金屬離子Cu(II)，使得C―O鍵減弱而鍵長增大，而另一個(gè)C—O鍵鍵長也因此略有伸長.C8—N2和C2—N1鍵長分別為1.479(5)?和1.477(5)?，與配體中的鍵長1.486(3)?(C2—N1)相比，稍有變短［5］.

在(Cu(C6H10NO4)2)的晶體結(jié)構(gòu)中，相鄰的分子將通過分子間氫鍵(見表4)和遠(yuǎn)距離弱的Cu…O鍵形成一維鏈狀結(jié)構(gòu)聚集體(見圖3).其中，Cu…O距離為2.824～2.858?(O為未配位的羧羰基氧)，與正常Cu—O鍵鍵長相差約0.9?(該分子中的Cu—O鍵長分別為1.944(3)?和1.947(3)?).這種擬變形八面體結(jié)構(gòu)，也可視為Cu(II)的d9電子構(gòu)型的J-T效應(yīng)的結(jié)果.

圖3 L-谷氨酸-5-甲酯合銅的1D結(jié)構(gòu)Fig.3 1D Structure of copper complex of5-methyl-L-glutamate

表4 氫鍵的鍵長和鍵角Tab.4 Bond lengths and bond angles of Hydrogen

2.3 對三磷酸腺苷二鈉水解反應(yīng)的影響

在室溫下，通過比色法測定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，從無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出的配體L-谷氨酸-5-甲酯及配合物(Cu(C6H10NO4)2)體系的OD值所對應(yīng)的無機(jī)磷含量，兩者均無磷含量.因此對ATP水解反應(yīng)，可認(rèn)為L-谷氨酸-5-甲酯和(Cu(C6H10NO4)2)均無催化活性.

2.4 抗菌活性分析

(Cu(C6H10NO4)2)對金黃色葡萄糖球菌、大腸埃希氏桿菌、枯草芽胞桿菌和普通變形桿菌的最小抑制濃度(MIC)見表5.由表5可見，除枯草芽胞桿菌外，(Cu(C6H10NO4)2)對其它測試微生物無抗菌活性.通常大多數(shù)化合物對Gram+菌的抗菌活性更強(qiáng)，但(Cu(C6H10NO4)2)對 Gram+菌與 Gram-菌的抗菌活性無區(qū)別.

表5 (Cu(C6 H10 NO4)2)的最小抑制濃度Tab.5 Minimum inhibitory concentration(MIC)of copper complex of 5-methyl-L-glutamate

3 結(jié)語

以自組裝的方法，在水溶劑中，用L-谷氨酸-5-甲酯和乙酸銅反應(yīng)，合成了L-谷氨酸-5-甲酯合銅.對L-谷氨酸-5-甲酯合銅的X-射線單晶衍射測定表明，L-谷氨酸-5-甲酯合銅屬單斜晶系，P2(1)空間群，其中a=9.5883(19)?，b=5.1521(10)?，c=15.562(3)?;β=98.65(3)°.在晶體結(jié)構(gòu)中，L-谷氨酸-5-甲酯合銅呈現(xiàn)為單核四配位結(jié)構(gòu)，每分子中含有2個(gè)L-谷氨酸-5-甲酯配體.配體通過羧羥基氧原子和氨基氮原子參加配位，形成一個(gè)“鉗狀”的平面構(gòu)型.在室溫下，L-谷氨酸-5-甲酯合銅對三磷酸腺苷二鈉的水解反應(yīng)不表現(xiàn)活性;它對枯草芽胞桿菌具有較好的抑制作用，MIC=25μg/mL.

［1］Aydin R，Yirikogullari A.Potentiometric study on complexation of divalent transition metal ions with amino acids and Adenosine5'-Triphosphate［J］.JChem Eng Data，2010，55(11)，4794-4800.

［2］Weibel N，Charbonnière L J，Guardigli M，et al.Engineering of highly luminescent lanthanide tags suitable for protein labeling and time-resolved luminescence imaging［J］.JAm Chem Soc，2004，126(15):4888-4896.

［3］Ahmed I T.Formation constants of ternary complexes involving some metal ions，tricine，dicarboxylic amino acids，aswellasN-(2-acetamido)iminodiacetic acid and 3-amino-5-mercapto-1，2，4-triazole［J］.J Chem Eng Data，2003，48(2)，272-276

［4］Djordjevic C，Vuletic N，Jacobs B A.Molybdenum(VI)peroxo α-amino acid complexes:synthesis，spectra，and properties of MoO(O2)2(α-aa)(H2O)for α-aa =glycine， alanine， proline， valine， leucine，serine，aparagine， gutamine， and gutamic aid.X-ray cystal sructures of the gycine，aanine，and poline cmpounds［J］.Inorg Chem.1997，36(9)，1798-1805.

［5］金龍飛，沈月松，吳勇飛，等.L-谷氨酸-5-甲酯金屬化合物的合成、表征和生物活性［J］.中南民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，30(1):17-20.

［6］李為明，王小妹.L-谷氨酰胺制備研究［J］.化工時(shí)刊，1999(9):16～19.

［7］Sheldrick G M.SHELXL97.program for the refinement of crystal structure ［M］.G?ttingen: University of G?ttingen，1997.

［8］Sheldrick GM.SADABS［M］.G?ttingen:University of G?ttingen，1996.

［9］Bruker AXS Inc.SMART APEX(Version 5.628)，SAINT+(Version 6.45)and SHELXTL-NT(Version 6.12) ［M］.Madison:Bruker AXS Inc，2001.

［10］Sheldrick G M.SHELXS97 and SHELXL97 ［M］.G?ttingen:University of G?ttingen，1997.

［11］張志良，瞿偉菁.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.3版.北京:高等教育出版社，2003:89-91.

［12］中國科學(xué)院上海植物生理研究所和上海市植物生理學(xué)會(huì).現(xiàn)代生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京:科學(xué)出版社，1999:104-106.

［13］劉國湘，張新信，胡德榮，等.氨基酸酯化方法的比較及其紅外光譜研究［J］.氨基酸和生物資源，1995，17(3):36-38.

［14］黃德如，汪仁慶.無機(jī)和配位化合物的紅外和拉曼光譜［M］.3版.北京:化工工業(yè)出版社，1986:235-239.

［15］樂學(xué)義，楊 光，盧其明.［Mn(H2O)(phen)2(PAc)］(ClO4)的合成、紅外光譜及晶體結(jié)構(gòu)［J］.無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)，2002，18(4):427-430.

［16］盧文貫，潘育方，彭翠紅.配合物［Cu(HPHAC)2(py)2］的合成和晶體結(jié)構(gòu)［J］.無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(5):721-724.

［17］馬衛(wèi)興，錢保華，高 健，等.配合物［Zn(tren)(HSSA)］的合成，晶體結(jié)構(gòu)及表征［J］.無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(4):612-616.

［18］Gaynor D，Starikova Z A，HaaseW，et al.Copper(II)complexes of isomeric aminophylhydroxamic acids.A novel'clam-like'dimeric metallacrown and polymeric helical structure containing interlinked unique copper(II)sites［J］.JChem Soc，Dolton Trans，2001，10:1578-1581.

［19］沈 良，王國平.銅(II)-苯甲酰苯丙氨酸-鄰菲羅啉混配配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及性質(zhì)研究［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，1998，10(1):48-53.

［20］Odunola O A，Adeoye I O，Woods J A O，et al.Synthesis and characterization of nickel(II)complexes of benzoic acid methyl substituted benzoic acid hydrazides and x-ray structure of Ni(C6H5CONHNH2)3·3CH3OH ［J］.Synth React Inorg Met-Org Chem，2003，33(2):205-221.