超高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜測定茶葉中手性農(nóng)藥茚蟲威對映體殘留

張新忠，羅逢健，陳宗懋，呂美玲

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究中心，浙江 杭州 310008；2.農(nóng)業(yè)部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；3.安捷倫科技中國有限公司，北京 100102）

超高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜測定茶葉中手性農(nóng)藥茚蟲威對映體殘留

張新忠1，2，羅逢健1，2，陳宗懋1，2，呂美玲3

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究中心，浙江 杭州 310008；2.農(nóng)業(yè)部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；3.安捷倫科技中國有限公司，北京 100102）

為了滿足茶葉中手性農(nóng)藥茚蟲威對映異構(gòu)體殘留檢測的需要，采用超高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF/MS）分析茶葉中手性農(nóng)藥茚蟲威對映異構(gòu)體的殘留。采用乙腈提取，F(xiàn)lorisil和GCB混合柱凈化，Lux 3μCellulose-1手性柱拆分，0.40mL/min V（0.10%甲酸水溶液）∶V（甲醇）＝15∶85的溶液作為流動(dòng)相，UHPLC-Q-TOF/MS基質(zhì)外標(biāo)法定性定量分析。茚蟲威兩個(gè)對映體在0.002 5～0.600 mg/L濃度范圍內(nèi)滿足線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.997 3和0.993 1，儀器檢測限為0.001mg/L；綠茶在0.01、0.10、1.00mg/kg 3個(gè)添加濃度水平下，平均添加回收率為80.75%～101.69%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于15%，方法定量限為0.002 5mg/kg。該方法準(zhǔn)確、可靠，能夠滿足茶葉中茚蟲威手性對映體殘留分析的需要。

茶葉；茚蟲威；手性農(nóng)藥；對映體拆分；殘留分析；超高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLC-QTOF/MS）

近年來，茶園中使用較多的吡蟲啉、啶蟲脒等農(nóng)藥，這些農(nóng)藥存在水溶性強(qiáng)、易在茶湯中浸出、影響人體飲用安全的問題，因此引起人們對茶葉中農(nóng)藥殘留安全性越來越多的關(guān)注［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球市場上有25%的農(nóng)藥為手性化合物［2］，而在研究農(nóng)藥殘留時(shí)，則很少關(guān)注農(nóng)藥手性對映異構(gòu)體的差別。茚蟲威是國家現(xiàn)代茶產(chǎn)業(yè)體系發(fā)現(xiàn)的一種對茶園茶樹假眼小綠葉蟬等有很好防治效果，用于替代吡蟲啉、啶蟲脒的脂溶性農(nóng)藥［3］，其化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖1，研究表明其有效體為S體，R體不具備殺蟲活性［4］。目前，對茚蟲威手性對映異構(gòu)體殘留分析［5］和拆分分析［6］的研究較少，且大多采用正相手性液相色譜紫外檢測法，該方法的靈敏度和準(zhǔn)確度較低，與質(zhì)譜的兼容性差。

茶葉是一種復(fù)雜基質(zhì)，目前未見有關(guān)茶葉中手性農(nóng)藥對映體殘留分析的研究報(bào)道。因此，為了滿足未來茶葉中茚蟲威農(nóng)藥手性對映體殘留檢測篩查的需要，為進(jìn)一步研究茚蟲威手性對映異構(gòu)體在茶葉中的選擇性降解遷移規(guī)律提供分析方法，本研究采用超高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF/MS）測定茶葉中手性農(nóng)藥茚蟲威對映體的殘留。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

圖1 茚蟲威化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of indoxacarb

UHPLC-Q-TOF/MS 6530系列：美國 Agilent公司產(chǎn)品，配以實(shí)時(shí)質(zhì)量校正的雙噴霧離子源；高速離心機(jī)：德國Sigma公司產(chǎn)品；電子分析天平（0.000 1g和0.01g）：瑞士 Mettler-Toledo公司產(chǎn)品；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司產(chǎn)品；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；T-18高速均質(zhì)勻漿器：德國IKA公司產(chǎn)品；DFT-200手提式高速萬能粉碎機(jī)：浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品；Vortex Genie2型渦旋振蕩器：美國Scientific Industries公司產(chǎn)品；玻璃柱管（10mm×200 mm）：杭州常盛科教器具廠產(chǎn)品；50mL離心管、0.22μm Filter Unit濾膜：天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品。

乙腈、甲醇、正己烷、丙酮（色譜純）：Honeywell公司產(chǎn)品；甲酸、NaCl、無水 MgSO4（分析純）：上海試四赫維化工有限公司產(chǎn)品；純凈水：杭州娃哈哈有限公司產(chǎn)品；Cleanert PestiCarb填料（石墨化炭黑GCB，120～400目）：天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品；硅鎂型吸附劑（Florlisil填料，60～100目，650℃烘4h，冷卻后按10%比例加入純凈水，密封振蕩混勻4h，放置干燥器中備用）：溫州市化學(xué)用料廠產(chǎn)品；Florlisil＋GCB混合柱：取2.0g Florlisil和0.050g GCB攪拌混合均勻，按照1g NaSO4、Florlisil＋GCB混合物、1g NaSO4順序裝入玻璃柱管中制成Florlisil＋GCB混合柱，10mL V（正己烷）∶V（丙酮）＝7∶3的溶液預(yù)淋洗；茚蟲威外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品（R 體∶S體＝1∶1，98%）：德國 Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品。

0.10%甲酸溶液：吸取1mL甲酸，加入至1 000mL純凈水中溶解，超聲脫氣，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 色譜－質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件 Lux 3μCellulose-1色譜柱（150mm×2.0mm）：美國Phenomenex公司產(chǎn)品；柱溫40℃；進(jìn)樣10μL；15%的0.10%甲酸水溶液（A）與85%甲醇（B）洗脫10min；流速0.40mL/min；R體與S 體的保留時(shí)間分別為3.55min和4.03min。

1.2.2 質(zhì)譜條件 ESI＋-Q-TOF/MS全掃描模式，毛細(xì)管電壓3 500V，干燥氣溫度300℃，干燥氣（N2）流速8L/min，霧化氣（N2）壓力2.41×105Pa，碎裂電壓130V，錐孔電壓65 V，倍增電壓750V，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 000，采集速率2spectra/s，參比離子 m/z 121.050 873和m/z922.009 798。

1.3 樣品處理

稱取2.00g粉碎后的綠茶粉，置于50mL塑料離心管中，加入10mL乙腈渦旋混勻，超聲浸泡20min后，加入1g NaCl渦旋混勻并均質(zhì)1min，以6 000r/min離心5min，取乙腈層6 mL至三角瓶，真空旋轉(zhuǎn)濃縮近干；加入5mL V（正己烷）∶V（丙酮）＝7∶3的溶液超聲溶解，上樣至Florilisil＋GCB混合柱，接收流出液；繼續(xù)加入25mL V（正己烷）∶V丙酮＝7∶3的溶液洗脫接收，濃縮近干；加入0.90mL甲醇超聲溶解；再加入0.10mL水，渦旋混勻；過0.22μm濾膜轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶，UHPLC-Q-TOF/MS進(jìn)樣5μL，基質(zhì)外標(biāo)法測定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取0.010 0g茚蟲威外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品至燒杯中，乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中定容，配制成200mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液（對映單體濃度為100mg/L），－18℃下避光保存。將儲備液用V（甲醇）∶V（水）＝9∶1的溶液稀釋成對映體濃度為0.600、0.200、0.050、0.020、0.005、0.002 5mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，UHPLC-QTOF/MS進(jìn)樣5μL，重復(fù)測定3次，以濃度為橫坐標(biāo)X，提取離子平均峰面積為縱坐標(biāo)Y，獲得茚蟲威對映體溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性相關(guān)系數(shù)及儀器檢出限。

1.5 添加回收率、精密度與方法定量限

稱取2.00g經(jīng)測定不含茚蟲威殘留的空白綠茶，分別添加1.00mL茚蟲威對映單體濃度為0.020、0.200和2.00mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液（即茚蟲威對映單體添加水平為0.01、0.10和1.00 mg/kg），每個(gè)濃度分別添加6份，渦旋混勻后放置過夜12h，以使更接近于實(shí)際樣品，然后按照1.3進(jìn)行提取凈化，待測；同時(shí)將提取凈化后獲得的空白綠茶基質(zhì)溶液加入相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中定容，作為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定，計(jì)算添加回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及方法定量限。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 手性色譜條件的優(yōu)化

文獻(xiàn)［5－6］分別采用Chiralpak?AS-H 柱 和Chiralcel?OD-H柱對茚蟲威手性對映體進(jìn)行正相拆分分析，獲得較好的拆分效果，但在正相條件下，無法與質(zhì)譜聯(lián)用以提高靈敏度，而這對茶葉等復(fù)雜基質(zhì)中的殘留分析顯得尤為重要。本研究在反相拆分條件下，對比了Lux 3μCellulose-1和Lux 3μCellulose-2兩種色譜柱，分別選取純水、0.10%甲酸水溶液和10mmol/L乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相A，甲醇或乙腈作為流動(dòng)相B，在不 同柱溫 （5～50 ℃）、不同流量（0.100～0.800mL/min）、不同流動(dòng)相（60∶40～10∶90）條件下的茚蟲威對映體拆分效果。

結(jié)果表明：Lux 3μCellulose-2柱拆分效果不如Lux 3μCellulose-1柱；乙腈拆分效果不如甲醇；加入離子化試劑甲酸、乙酸銨等對拆分效果影響不大，但有利于茶葉基質(zhì)中的雜質(zhì)洗脫出來，延長色譜柱壽命，同時(shí)對茚蟲威離子化的［M＋H］＋峰與［M＋Na］＋的比例亦有一定影響，能抑制［M＋Na］＋的生成，促進(jìn)［M＋H］＋的生成。因此最終選擇Lux 3μCellulose-1柱作為茚蟲威手性對映體的拆分分析柱，0.10%甲酸水溶液（A）與甲醇（B）作為流動(dòng)相。

色譜柱柱溫和流量的降低會(huì)使容量因子明顯加大，分離因子稍有加大，分離度加大，但峰型展寬且會(huì)出現(xiàn)拖尾，不同色譜柱柱溫下拆分效果示于圖 2；柱溫 30 ℃，流速 0.30mL/min，0.10%甲酸水溶液（A）與甲醇（B）流動(dòng)相在不同比例下對茚蟲威的拆分效果示于圖3，當(dāng)V（甲醇）∶V（0.10%甲酸）＝60∶40時(shí)，30min內(nèi)未見茚蟲威對映異構(gòu)體流出，甲醇比例越高，茚蟲威保留時(shí)間越短，但拆分效果越弱；進(jìn)樣液與流動(dòng)相比例接近相對于單純有機(jī)溶劑進(jìn)樣，可以提高分離度。最終選擇的色譜拆分分析條件見1.2。

圖2 不同色譜柱溫度下Lux Cellulose－1拆分茚蟲威對映體的效果Fig.2 The enantioseparation effect of indoxacarb at different temperatures by Lux Cellulose-1column

通過對當(dāng)前市場上茚蟲威農(nóng)藥分析并結(jié)合文獻(xiàn)［7］推斷對映體1為R體，對映體2為S體，最佳分析條件下，杜邦商品農(nóng)藥凱恩?的拆分色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品對比色譜圖示于圖4。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

茚蟲威［M＋H］＋峰測定的質(zhì)荷比為m/z528.076 3，計(jì)算的理論質(zhì)荷比為m/z528.078 5，誤差－4.17×10－6；［M＋Na］＋峰測定的質(zhì)荷比為m/z550.058 9，計(jì)算的理論質(zhì)荷比為m/z550.059 9，誤差＋1.82×10－6。在測定過程中發(fā)現(xiàn)［M＋Na］＋峰強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于［M＋H］＋峰，故對全掃描圖譜采用［M＋Na］＋峰理論值±10×10－6誤差提取離子流進(jìn)行定量分析，［M＋H］＋峰輔助定性分析，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見1.2。采用 Q-TOF/MS掃描，用準(zhǔn)確質(zhì)荷比提取離子流進(jìn)行定性定量分析，比普通的LC/DAD或LC/MS方法有更好的靈敏度和準(zhǔn)確度。

圖3 Lux Cellulose-1柱中流動(dòng)相甲醇（B）與0.10%甲酸水溶液（A）在不同比例下對茚蟲威拆分效果Fig.3 The enantioseparation effect of indoxacarb at different mobile phase compositons by Lux Cellulose-1

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（a）與杜邦公司商品化農(nóng)藥凱恩?的拆分色譜圖（b）對比Fig.4 The comparative chromatogram of standard solution（A）and Dupont pesticide KAI-ENG? （B）

2.3 提取凈化方法的優(yōu)化

茚蟲威難溶于水，易溶于乙腈、丙酮等有機(jī)溶劑，對茶葉中茚蟲威殘留的提取多采用乙腈［8－10］、氯化鈉水溶液結(jié)合V（丙酮）∶V（正己烷）＝3∶7［11］等。前期研究［12］對比了綠茶添加樣分別采用乙腈、丙酮、水＋乙腈提取的效果，結(jié)果在回收率上差別不大，但是丙酮提取的色素類雜質(zhì)多，會(huì)增加后續(xù)凈化的難度；對于水溶解度較小的農(nóng)藥茚蟲威，干茶樣中加入水浸泡提取并不能改善提取效果，反而會(huì)增加咖啡堿等水溶性雜質(zhì)的浸出，而加大后續(xù)凈化的難度。因此最終選擇茶葉直接加入乙腈均質(zhì)提取，既能減少雜質(zhì)共提物，又有較好的回收率。

茶葉中農(nóng)藥殘留分析凈化時(shí)，多采用GCB［11］、TPT 混 合 填 料 柱［8－9］、凝 膠 滲 透 色 譜GPC［13］以及 QuEChERs［10，14］等方法凈化。本研究嘗試采用2g Florlisil柱凈化1.2g綠茶提取液，同時(shí)混合加入0.050g GCB填料用于吸附除去部分色素，既能節(jié)省試驗(yàn)成本，相對于QuEChERs等凈化方法，又能更好地去除咖啡堿、兒茶素等雜質(zhì)共提物，保證凈化效果并降低了后期質(zhì)譜離子源等的維護(hù)。圖5給出了30 mL不同體積比的正己烷－丙酮對Florlisil＋GCB柱上手性農(nóng)藥茚蟲威對映體的洗脫效果。結(jié)果表明V（正己烷）∶V（丙酮）＝7∶3時(shí)，回收率和凈化效果最佳，最終選擇2.0g Florlisil＋0.050g GCB混合柱凈化，30mLV（正己烷）∶V（丙酮）＝7∶3的溶液作為洗脫劑。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、添加回收率、精密度和定量限

在0.002 5、0.005、0.020、0.050、0.200和0.600mg/L標(biāo)準(zhǔn)濃度下，手性農(nóng)藥茚蟲威對映體S體和R體分別滿足線性方程y＝9 443 775x＋116 891和y＝6 310 326x＋137 072，線性相關(guān)系數(shù)r分別為0.997 3和0.993 1，儀器檢出限為0.001mg/L。

圖5 不同比例的正己烷－丙酮洗脫Florlisil＋GCB柱上手性農(nóng)藥茚蟲威對映體的回收率Fig.5 The elution recoveries of indoxacarb enantiomers at the mix-column of florisil and GCB by different compositions of hexane and acetone

空白綠茶粉添加標(biāo)準(zhǔn)后混勻放置12h再進(jìn)行分析，基質(zhì)外標(biāo)法定量，平均回收率為80.75%～101.69%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為5.58%～14.48%，根據(jù)最低添加濃度下的信噪比S/N＝10，計(jì)算得方法定量限為0.002 5 mg/kg，詳細(xì)結(jié)果列于表1，相關(guān)色譜圖示于圖6。A～D分別為總離子流色譜圖，a～d分別為［M＋Na］＋峰m/z550.059 9±10×10－6提取離子流色譜圖。根據(jù)3個(gè)濃度下的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液對比發(fā)現(xiàn)，茚蟲威具有較強(qiáng)的基質(zhì)減弱效應(yīng)，因此在實(shí)際測定時(shí)，應(yīng)用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行定量以確保定量的準(zhǔn)確度。

表1 UHPLC－Q-TOF/MS測定綠茶中茚蟲威對映體的添加回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和方法定量限Table 1 The spiked recoveries，relative standard deviations（RSDs）and limits of quantification（LOQs）of indoxacarb enantiomers in green tea by UHPLC-Q-TOF/MS

圖6 UHPLC-Q-TOF/MS分析綠茶中茚蟲威對映體的溶劑標(biāo)準(zhǔn)（A，a）、添加回收（B，b）、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（C，c）和空白（D，d）色譜圖Fig.6 The solvent standard（A，a），green tea spiked（B，b），matrix standard（C，c），blank sample（D，d）chromatogram of indoxacarb enantiomers by UHPLC-Q-TOF/MS

3 結(jié)論

本研究建立了茶葉中手性農(nóng)藥茚蟲威對映體殘留的UHPLC-Q-TOF檢測方法，該方法快速、定性準(zhǔn)確度高、檢測限低，能夠滿足未來茶葉中茚蟲威農(nóng)藥手性對映體殘留檢測篩查的需要，為進(jìn)一步研究茚蟲威手性對映異構(gòu)體在茶葉中的選擇性降解遷移規(guī)律提供了分析方法。

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Enantioseparation and Quantification of Chiral Pesticide Indoxacarb Residues in Tea by UHPLC-Q-TOF/MS

ZHANG Xin-zhong1，2，LUO Feng－jian1，2，CHEN Zong-mao1，2，LU Mei-ling3
（1.Research Center of Quality Safety for Agricultural Products，Tea Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou310008，China；2.Tea Product Quality and Safety Risk Assessment Laboratory，Ministry of Agriculture，Hangzhou310008，China；3.Agilent Technologies，Inc.，Beijing100102，China）

In order to meet the need of enantioseparation and quantification of chiral pesticide indoxacarb residue determination in tea，an effective reversed phase chiral analytical method was developed for the resolution and determination of indoxacarb enantiomers in tea by ultra-high pressure liquid chromatography－quadrupole-time of flight mass spectrometry（UHPLC-Q-TOF/MS）.Indoxacarb enantiomers were extracted by acetonitrile followed byFlorisil and GCB mix-column cleanup from tea，then separated on a Lux 3μCellulose-1column withV（0.10%formic acid）∶V（methanol）＝15∶85as the mobile phases at 0.40 mL/min.Over the concentrations in the range of 0.002 5—0.600mg/L for both of indoxacarb enabtiomers，the correlation coefficients（r）of the calibration curves are 0.997 3and 0.993 1for each other，and the estimated limits of detection（LODs）are 0.001mg/L.The average recoveries of two indoxacarb enantiomers in green tea at three spiked concentration levels（0.01，0.10and 1.00mg/kg）range from 80.75%to 101.69%with relative standard deviations（RSDs）lower than 15% （n＝6）.The limits of quantitation（LOQs）of two indoxacarb enabtiomers are 0.002 5mg/kg in green tea.The result shows that this method is reliable，accurate and suitable for the residue determination of indoxacarb enantiomers in tea.

tea；indoxacarb；chiral pesticide；enantioseparation；residue；ultra-high pressure liquid chromatography－quadrupole-time of flight mass spectrometry（UHPLC-Q-TOF/MS）

O657.63

A

1004-2997（2012）06-0321-06

2012-08-08；

2012-10-16

國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-23）、國家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（21107137）、安捷倫公司合作項(xiàng)目資助

張新忠（1982～），男（土家族），湖南張家界人，博士，副研究員，從事農(nóng)藥殘留色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析研究。

E-mail：zxz.1982＠163.com

陳宗懋（1933～），男，浙江海鹽人，中國工程院院士，從事食品安全與化學(xué)生態(tài)學(xué)研究。E-mail：chenzm＠m(xù)ail.tricaas.com