HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)定量測定人血漿中伊伐布雷定及其代謝產(chǎn)物

賈艷艷，鹿成濤，宋 穎，丁莉坤，楊 靜，陳敏純，李雪晴，宋 薇，周 倫，馮智軍，文愛東

（中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 西安710032）

HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)定量測定人血漿中伊伐布雷定及其代謝產(chǎn)物

賈艷艷，鹿成濤，宋 穎，丁莉坤，楊 靜，陳敏純，李雪晴，宋 薇，周 倫，馮智軍，文愛東

（中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 西安710032）

為了定量測定人血漿中伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定濃度，建立了HPLC-MS/MS聯(lián)用方法以地西泮為內(nèi)標，V（甲醇）∶V水（5mM醋酸銨＋1%甲酸）＝80∶20的混合溶液為流動相，Diamosil C18（150mm×4.6mm，5μm）色譜柱為分析柱，通過電噴霧離子源（ESI），以正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式檢測。用于定量分析的離子對分別為m/z469.2→177.1（伊伐布雷定），m/z455.2→177.1（去甲伊伐布雷定），m/z285.1→193.1（地西泮）。伊伐布雷定的標準曲線線性范圍為0.101 3～101.3μg/L，定量下限為0.101 3μg/L；去甲伊伐布雷定的標準曲線線性范圍為0.085～25.5μg/L，定量下限為0.085μg/L。日內(nèi)、日間精密度的RSD＜15%，平均回收率＞75%。

伊伐布雷定；去甲伊伐布雷定；高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜；血漿藥物濃度

鹽酸伊伐布雷定是一種減緩心率藥，起到減緩竇房結(jié)起搏點活動速度的作用，用于治療慢性穩(wěn)定型心絞痛。伊伐布雷定常見的不良反應(yīng)為心動過緩、房室傳導(dǎo)1度阻滯、室性期外收縮、頭痛、眩暈和視力模糊與其劑量存在依賴性［1－2］。伊伐布雷定在體內(nèi)經(jīng)肝藥酶代謝成去甲伊伐布雷定，從而發(fā)揮減慢心率的作用，是臨床常用的藥物［3－5］，但目前國內(nèi)暫無伊伐布雷定及其代謝產(chǎn)物體內(nèi)定量檢測方法的研究報道。本試驗建立了伊伐布雷定及其代謝產(chǎn)物在人血漿中定量檢測的方法，并用于人體藥動學(xué)研究。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

6410型高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，其中安捷倫1200高效液相色譜系統(tǒng)包括二元輸液泵、自動進樣器、柱溫箱，串聯(lián)質(zhì)譜儀為Agilent 6410型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，包含電噴霧離子化源以及串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測器；色譜工作站：MassHunter數(shù)據(jù)處理軟件，美國Agilent公司產(chǎn)品；FA1004電子天平：上海恒平科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；Milli-Q Plus純水器：美國密理博中國有限公司產(chǎn)品；XW-80A微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器有限公司產(chǎn)品；TGL 16G臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；KS康氏振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

鹽酸伊伐布雷定對照品（含量99.13%，批號：YF-D01），鹽酸去甲伊伐布雷定對照品（含量99.13%，批號：091007）：由常州四藥制藥有限公司提供；地西泮對照品（內(nèi)標，批號：100294-200602）：由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇，磷酸（色譜純）：美國Fisher公司產(chǎn)品；水：自制純化水；空白血漿：由第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供；實驗用水為去離子水，實驗室自制。

1.3 HPLC-MS/MS分析條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：迪馬公司DIAMOSIL C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：V（甲醇）∶V 水（5mmol/L醋酸銨＋0.1%甲酸）＝80∶20的混合溶液；流速0.6mL/min；柱溫40℃；進樣量5μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源（ESI源），正離子模式檢測，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式，毛細管電壓4 000V，駐留時間150ms，干燥氣溫度325℃，干燥氣流速12L/min，霧化氣壓力345kPa。以多反應(yīng)監(jiān)測的質(zhì)譜掃描方式分析，測定伊伐布雷定，用于定量分析的離子對m/z 469.2→177.1，碰撞電壓25eV，裂解電壓140 V；去甲伊伐布雷定，用于定量分析的離子對m/z455.2→177.1，碰撞電壓23eV，裂解電壓140 V；地西泮（內(nèi)標），用于定量分析的離子對m/z 285.1→193.1，碰撞電壓32eV，裂解電壓150 V，所得的質(zhì)譜圖示于圖1。

1.4 試驗步驟

1.4.1 血漿樣品的處理 精密量取1mL血漿樣品于10mL玻璃離心管中，加入50μL內(nèi)標溶液（2mg/L地西泮溶液），旋渦30s后混勻，加入4mL乙酸乙酯，渦漩3min，以4 000r/min離心10min。吸取有機層，在30℃水浴中以氮氣流吹干，殘渣以200μL流動相復(fù)溶，以16 000 r/min離心8min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至自動進樣器樣品管中，進樣量5μL，進行 LC-MS/MS分析。

1.4.2 標準曲線和質(zhì)控樣品的制備 精密稱量11.01mg鹽酸伊伐布雷定標準品 （含10.13mg伊伐布雷定標準品），置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，得伊伐布雷定濃度為1.013 g/L，作為儲備液備用，然后用空白血漿依次稀釋配制 成 濃 度 為 0.101 3、0.303 9、1.013、3.039、10.13、30.39、101.3μg/L的標準含藥血漿。按照1.4.1方法進行處理并測定。同樣步驟再次配制濃度為0.202 6、5.065、75.975μg/L的質(zhì)控樣品。

圖1 伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定及內(nèi)標地西泮質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of ivabradine，N-desmethylivabradine and Diazepam（IS）

精密稱取4.63mg鹽酸去甲伊伐布雷定標準品 （內(nèi)含4.25mg去甲伊伐布雷定），置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至10mL，溶解搖勻，即得0.425g/L伊伐布雷定的儲備液，然后用空白血漿依次稀釋配制成濃度為0.085、0.255、0.85、2.55、8.5、17、25.5μg/L 的標準含藥血漿。按照1.4.1方法進行處理并測定。同樣步驟再次配制濃度為0.17、2.55、12.75μg/L的質(zhì)控樣品。

1.4.3 穩(wěn)定性考察 在不同的試驗條件下對質(zhì)控樣品進行穩(wěn)定性試驗（n＝3）：1）質(zhì)控樣品在－80℃冰箱中完全冷凍后取出，在室溫環(huán)境下解凍，然后再次放入冰箱，如此反復(fù)3次后制備并測定；2）質(zhì)控樣品在室溫下放置4h后制備并測定；3）質(zhì)控樣品在－80℃下避光保存，1個月后制備并測定；4）質(zhì)控樣品在進樣器放置4h后制備并測定。

2 方法與結(jié)果

2.1 特異性考察

分別取6個不同受試者的1mL空白血漿，除不加入內(nèi)標溶液外，其余按血漿樣品分析方法處理，進樣5μL，獲得空白樣品的色譜圖，示于圖2a；將一定濃度的伊伐布雷定標準溶液、去甲伊伐布雷定標準溶液和內(nèi)標地西泮溶液加入空白血漿中，用相同的方法進行樣品處理，獲得相應(yīng)的色譜圖，示于圖2b；受試者服藥5mg伊伐布雷定片0.5h后的色譜圖示于圖2c。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)并未干擾伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定和內(nèi)標的測定。

圖2 血漿中伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定、地西泮的典型多反應(yīng)監(jiān)色譜圖Fig.2 Representative chromatograms for ivabradine，N-desmethylivabradine，and IS.

2.2 基質(zhì)效應(yīng)考察

分別用甲醇配制相當于血漿濃度0.202 6、5.065、75.975μg/L的伊伐布雷定樣品各1 mL，相當于血漿濃度0.17、2.55、12.75μg/L的去甲伊伐布雷定樣品各1mL，加入50μL內(nèi)標，每種濃度各做10份，以氮氣吹干。其中5份樣品以200μL流動相復(fù)溶，另外5份以空白血漿提取液復(fù)溶，以16 000r/min離心8min，移取上清液至自動進樣瓶，進樣分析，流動相復(fù)溶峰面積比值平均值記為fR，空白血漿提取液復(fù)溶樣品峰面積記為fs，按下式計算基質(zhì)效應(yīng)（RE），RE＝（fs/fR）×100%。結(jié)果顯示：伊伐布雷定高、中、低3個濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為2.8%、2.1%、3.7%，去甲伊伐布雷定高、中、低3個濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為2.5%、1.7%、6.3%，RSD均小于15%，可認為沒有基質(zhì)效應(yīng)干擾。

2.3 標準曲線和線性范圍

以待測化合物和內(nèi)標峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，權(quán)重系數(shù)1/x，進行線性回歸計算，得到伊伐布雷定標準曲線：f＝0.003 848＋0.057 28C，線性相關(guān)系數(shù)r為0.998；去甲伊伐布雷定標準曲線：f＝0.001 061＋0.019 807C，線性相關(guān)系數(shù)r為0.999，而且各點標示濃度和計算濃度的偏差都在±15μg/L以內(nèi)（最低定量限為±20μg/L）。伊伐布雷定的最低定量（LLOQ）濃度為0.101 3μg/L，其日內(nèi)精密度RSD為10.8%，日間精密度RSD為5.4%；去甲伊伐布雷定的最低定量濃度為0.085μg/L，其日內(nèi)精密度RSD為8.4%，日間精密度RSD為4.7%，符合要求。

2.4 精密度和準確度

方法學(xué)考核伊伐布雷定濃度為0.202 6、5.065、75.975μg/L的質(zhì)控樣品（n＝6），去甲伊伐布雷定濃度為0.17、2.55、12.75μg/L的質(zhì)控樣品（n＝6），考核批次為3次，結(jié)果列于表1。結(jié)果表明，此方法的精密度和準確度偏差均在±15%以內(nèi)。

2.5 穩(wěn)定性

分別在－80℃反復(fù)凍融3次、血漿室溫放置4h、－80℃下凍存3個月、進樣器放置4h（n＝3），4種條件下考察方法的穩(wěn)定性，結(jié)果列于表2。結(jié)果表明，伊伐布雷定及去甲伊伐布雷定在這4種條件下的穩(wěn)定性良好。

表1 伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定的回收率和精密度Table 1 Precision and recovery of ivabradine and N-desmethylivabradine

表2 伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定的穩(wěn)定性Table 2 Stability of ivabradine and N-desmethylivabradine

2.6 提取回收率試驗

取10mL玻璃離心管數(shù)支，分別加入不同量的伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定標準溶液，以氮氣流吹干，加入2.5mL空白血漿提取液，配制成含0.202 6、5.065、75.975μg/L伊伐布雷定血漿樣品及含0.17、2.55、12.75μg/L去甲伊伐布雷定血漿樣品，渦漩混勻后，按1.4.1處理，記錄色譜圖，計算峰面積比值fi（fi＝As/Ai）。并計算每種濃度的平均值。

取10mL玻璃離心管數(shù)支，配成含0.202 6、5.065、75.975μg/L的含伊伐布雷定血漿標準樣品及含0.17、2.55、12.75μg/L的去甲伊伐布雷定血漿標準樣品，每種濃度各做5份，除不加內(nèi)標外，按1.4操作，取上清液2.5mL，加入50μL內(nèi)標標準液，渦漩后，于35℃水浴中以氮氣流吹干，用200μL流動相復(fù)溶，以16 000 r/min離心3min，移取上清液至自動進樣器，5 μL進樣分析，記錄色譜圖，計算峰面積比值fs（fs＝As/Ai）。將上述fs和的比值代入下式，即可求得伊伐布雷定的絕對回收率（R%），R%結(jié)果列于表3。

表3 伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定的提取回收率Table 3 Recovery of ivabradine andN-desmethylivabradine

2.7 方法應(yīng)用

應(yīng)用本方法測定10名中國成年健康志愿者單劑量口服5mg鹽酸伊伐布雷定后，不同時間血漿中伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定的濃度，并計算藥代動力學(xué)參數(shù)，其平均血藥濃度－時間曲線示于圖3。藥代動力學(xué)參數(shù)結(jié)果為：伊伐布雷定t1/2：（5.18±1.20）h，AUC（0－48）：（169.56±33.15）（μg·h）/L，Cmax：（35.88±8.88）μg/L，tmax：（1.08±0.53）h；代謝產(chǎn)物去甲伊伐布雷定t1/2：（9.91±1.24）h，AUC（0－48）（23.87±9.43）（μg·h）/L，Cmax為（3.11±1.62）μg/L，tmax：（1.30±0.26）h。

圖3 健康志愿者口服5mg伊伐布雷定片后的平均血藥濃度－時間曲線Fig.3 Mean plasma concentration-time profiles of ivabradine and N-desmethylivabradine after single oral dose of 5mg ivabradine hydrochloride tablets

3 討論

目前國際上有3篇關(guān)于伊伐布雷定及去甲伊伐布雷定檢測方法研究報道，其中1篇為熒光檢 測 法［6］，2 篇 為 質(zhì) 譜 聯(lián) 用 法［7－8］。 但 鑒 于 伊 伐布雷定及去甲伊伐布雷定的檢測下限較低，采用質(zhì)譜聯(lián)用法較為妥當，但上述2篇研究報道均采用固相萃取處理方法，成本較高，不適用于大批樣品的預(yù)處理。針對上述情況，本試驗建立了液液萃取的樣品預(yù)處理方法，成本低廉、重現(xiàn)性高、易于操作，且血漿中的雜質(zhì)不干擾樣品的測定。伊伐布雷定的標準曲線線性范圍為0.101 3～101.3μg/L，去甲伊伐布雷定的標準曲線線性范圍為0.085～25.5μg/L，線性關(guān)系良好；伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定的高、中、低3個濃度的批內(nèi)和批間精密度均小于15%；相對回收率在98.7～108.2%之間；伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定血漿樣品室溫放置4h，－80℃下反復(fù)凍融3次，－80℃下凍存3個月及檢測樣品進樣器放置4h條件下的穩(wěn)定性良好，符合生物樣品分析要求。此外，目前國際上有2篇關(guān)于伊伐布雷定與其他藥物相互作用的文章［9－10］，報道了肝藥酶誘導(dǎo)劑卡馬西平可提高伊伐布雷定的生物利用度高近80%，但主經(jīng)肝藥酶CYP3A4和CYP2C19代謝的奧美拉唑并不影響伊伐布雷定代謝，兩者之間不存在任何相互作用，上述研究均提示在臨床應(yīng)用過程中需注意伊伐布雷定的應(yīng)用，避免因藥物相互作用而出現(xiàn)不良反應(yīng)。

［1］FERRARI R，CARGNONI A，CECONI C.Antiischaemic effect of ivabradine［J］.Pharmacology research，2006，53：435-439.

［2］BORER J S，F(xiàn)OX K，JAILLON P，et al.Ivabradine Investigators Group.Antianginal and antiischemic effects of ivabradine，an I（f）inhibitor，in stable angina：A randomized，double-blind，multicentered，placebo-controlled trial［J］.Circulation，2003，107（6）：817-823.

［3］LóPEZ-BESCóS L，F(xiàn)ILIPOVA S，MARTOS R.Long-term safety and efficacy of ivabradine in patients with chronic stable angina［J］.Cardiology，2007，108（4）：387-396.

［4］RUZYLLO W，TENDERA M，F(xiàn)ORD I，et al.Antianginal efficacy and safety of ivabradine compared with amlodipine in patients with stable effort angina pectoris： A 3-month randomised，double-blind，multicentre，noninferiority trial［J］.Drugs，2007，67（3）：393-405.

［5］SEBASTIAN N，HENNING E，ROBERT S H，et al.Reducing elevated heart rate in patients with multiple organ dysfunction syndrome by the If（funny channel current）inhibitor ivabradine MODIFY Trial［J］.Clinical Research in Cardiology，2011，100（10）：915-923.

［6］KLIPPERT P，JEANNIOT P，POLVE S，et al.Determination of ivabradine and its N-demethylated metabolite in human plasma and urine，and in rat and dog plasma by a validated high-performance liquid chromatographic method with fluorescence detection［J］.Journal of Chromatography B，1998，719：125-133.

［7］FRANCOIS-BOUCHARD M，SIMONIN G，BOURSIER-NEYRET C.Simultaneous determination of ivabradine and its metabolites in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B，2000，745：261-269.

［8］RIESEN S C，NI W，CARNES C A，et al.Pharmacokinetics of oral ivabradine in healthy cats［J］.J Vet Pharmacol Ther，2011，34（5）：469-475.

［9］VLASE L，NEAG M，POPA A，et al.Pharmacokinetic interaction between ivabradine and carbamazepine in healthy volunteers［J］.J Clin Pharm and Ther，2010，36（2）：225-229.

［10］PORTOLéS A，CALVO A，TERLEIRA A，et al.Lack of pharmacokinetic interaction between omeprazole or lansoprazole and ivabradine in healthy volunteers：an open-label，randomized，crossover，pharmacokinetic interaction clinical trial［J］.J Clin Pharmacol，2006，46（10）：1 195-1 203.

Quantitative Determination of Ivabradine and N-Desmethylivabradine in Human Plasma by HPLC-MS/MS

JIA Yan-yan，LU Cheng-tao，SONG Ying，DING Li-kun，YANG Jing，CHEN Min-chun，LI Xue-qin，SONG Wei，ZHOU Lun，F(xiàn)ENG Zhi-jun，WEN Ai-dong
（Department of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Fourth Military Medical University of PLA，Xi’an710032，China）

Ivabradine and N-desmethylivabradine in human plasma was determined by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）.Diazepam was used as internal standard.Ivabradine and N-desmethylivabradine was separated on a Diamosil C18column（150mm×4.6mm×5μm）.Electrospray ionization（ESI）source was applied，and multiple reaction monitoring（MRM）mode was operated in the positive mode with the monitor ions at m/z469.2→177.1for ivabradine，m/z455.2→177.1for N-desmethylivabradine and m/z285.1→193.1for the interna1standard，respectively.The linear calibration curve are obtained over the concentration range of 0.101 3—101.3μg/L for ivabradine and 0.085—25.5μg/L for N-desmethylivabradine.The limit of quantitation are 0.101 3μg/L and 0.085μg/L for ivabradine and N-desmethylivabradine，respectively.The inter-day and intra-day precision（RSD）is less than 15%.The average recoveries are above 75%.

ivabradine；N-desmethylivabradine；high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）；plasma concentration

O 657.63

A

1004-2997（2012）03-0081-06

2011-10-05；

2011-12-14

賈艷艷（1981～），女（漢），河北遵化人，主管藥師，從事臨床藥理學(xué)研究。E-mail：jiayanyan-2004＠hotmail.com。

文愛東（1965～），男（漢），陜西西安人，主任藥師，從事臨床藥理學(xué)研究。E-mail：adwen-2004＠hotmail.com