高效液相色譜法測定醋酸潑尼松片中相關(guān)物質(zhì)含量

賀 穎，董得時(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧大連 116000)

醋酸潑尼松為一種腎上腺皮質(zhì)類激素藥，能夠抗過敏、抗炎、抗風(fēng)濕及免疫抑制，是臨床上的常用藥之一?！吨腥A人民共和國藥典:二部》(2000年版)中收錄的醋酸潑尼松片含量測定方法為紫外分光光度法［1］，雖然此法簡單，但其選擇性較差，專屬性不強，結(jié)果可能受片劑中的其他添加劑或輔料的干擾，而對于一些有意的造假產(chǎn)品，也常常出現(xiàn)“合格”的檢測結(jié)果。因此本文筆者根據(jù)相關(guān)資料［2-5］及《中華人民共和國藥典》(2010年版)中醋酸潑尼松原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查方法，采用高效液相色譜法測定醋酸潑尼松片中醋酸潑尼松、潑尼松、醋酸可的松的含量，現(xiàn)報告如下。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀(美國，2487型紫外檢測器、1525型輸液泵、717自動進(jìn)樣器、2996型檢測器、waterts Empower色譜軟件)，電子天平(SartorisBS110S十萬分之一天平)。

醋酸潑尼松對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:100012-200105);潑尼松對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:100199-199401);醋酸可的松對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:100123-200303);醋酸潑尼松片(規(guī)格:5 mg);乙腈為色譜純，水為怡寶純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 ZORBAX SB C18(規(guī)格:4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(58∶42)，流速為 1.0 mL·min-1，柱溫30℃，檢測波長為240 nm，進(jìn)樣量取10 μL。醋酸潑尼松的色譜圖如圖1。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取醋酸潑尼松、潑尼松、醋酸可的松對照品至25～50 mL容量瓶中，加流動相溶解，定量稀釋至各含0.5 mg·mL-1的混合溶液，精密吸取1 mL，置于100 mL量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

圖1 醋酸潑尼松HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of prednisone acetate

2.3 供試品溶液的制備

取本品20片，研細(xì)，精密稱取約相對于醋酸潑尼松12.5 mg，置于50 mL量瓶中，加入30 mL流動相振搖20 min使之溶解，加入流動相至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液則為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

分別取醋酸潑尼松、潑尼松、醋酸可的松對照品溶液1.0、2.5、5、10、20、30、40 μL 進(jìn)樣，測定，橫坐標(biāo)為濃度(C)，縱坐標(biāo)為峰面積(A)，進(jìn)行線性回歸。得回歸方程:A醋酸潑尼松=0.77C-5.03 ×10-3，A潑尼松=0.91C-5.26 × 10-3，A醋酸可的松=0.69C-4.85×10-3，r=0.999 9。結(jié)果顯示醋酸潑尼松、潑尼松、醋酸可的松在濃度范圍0.52～30.81 μg·mL-1之間有良好的線性關(guān)系。

2.5 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批號供試品分別按“2.3”項下方法制備5份，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測得醋酸可的松平均含量為9.812 6 mg·g-1，峰面積RSD=1.0%，說明本法的重復(fù)性佳。

2.6 精密度試驗

精密吸取同一批號供試品溶液10 μL，依法進(jìn)樣5次，測得潑尼松平均峰面積為0.202 8，RSD=1.22%，說明儀器的精密度佳。

2.7 穩(wěn)定性試驗

分別在 0、1、2、4、8、12 h 精密吸取同一供試品溶液10 μL，進(jìn)樣測定，潑尼松在12 h內(nèi)平均峰面積為0.217 6，RSD=1.12%，說明供試品溶液在室溫12 h內(nèi)的穩(wěn)定性佳。

2.8 加樣回收試驗

精密稱取已知含量供試品6份，精密加入醋酸潑尼松對照品5 mg，按“2.3”項下制備回收率試驗溶液，依法測定，計算回收率，見表1。

2.9 相關(guān)物質(zhì)的測定

按照“2.1”項中色譜條件，量取對照溶液20 μL進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使醋酸潑尼松的峰高為滿量程的20%。精密量取供試品溶液與對照溶液各20 μL，進(jìn)樣，記錄色譜圖到主成分峰2倍保留時間。若在供試品溶液色譜圖中出現(xiàn)與對照品溶液中潑尼松、醋酸可的松保留時間相同的峰，則根據(jù)外標(biāo)法計算其峰面積，其含量分別不得大于0.5%、1.5%。各雜質(zhì)峰面積總和不得超過對照品溶液中醋酸潑尼松峰2倍面積。供試品溶液色譜圖中去除相對主峰保留時間0.44倍前的輔料峰及小于醋酸潑尼松峰面積0.01倍色譜峰。10個廠家的樣品測定結(jié)果見表2。

表1 加樣回收試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery test

表2 醋酸潑尼松片中相關(guān)物質(zhì)含量的檢測結(jié)果(%)Tab 2 Determination results of related substances in Prednisone Acetate Tablets(%)

3 討論

本研究中采用研磨溶解，能夠?qū)⑤^大顆粒研成微小顆粒，從而均勻分散于溶劑中，其分散性較好，利于醋酸潑尼松溶出率的提高，因此結(jié)果的準(zhǔn)確度高，大大降低了實驗方法中的誤差［6］。

通過Waters高效液相色譜儀檢測，醋酸潑尼松、潑尼松與醋酸可的松的最大吸收波長均為240 nm，故選擇檢測波長為240 nm。以甲醇-水(58∶42)為流動相能有效分離，最終獲得滿意結(jié)果。因醋酸潑尼松、潑尼松與醋酸可的松均溶解于流動相中，故以流動相作為溶劑。

由圖1可見，醋酸潑尼松供試品溶液在3 min左右出現(xiàn)1雜峰，在同樣條件下對照品溶液在該處卻無吸收峰，說明在240 nm下運用紫外分光光度法未能排除醋酸潑尼松片中的添加劑及輔料等，故對醋酸潑尼松吸收度產(chǎn)生干擾而可能影響測定結(jié)果，但采用HPLC因?qū)⒋姿釢娔崴膳c其他雜質(zhì)分離，因此不受到干擾。

由于水與甲醇混合時形成空氣過飽和溶液，此時會產(chǎn)生大量氣泡并釋放熱量［7］，故需放置待氣泡散盡冷卻后使用。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:二部［S］.2000年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000:1023.

［2］ 陳 杰，李 展.HPLC測定鹽酸安非他酮片的含量［J］.華西藥學(xué)雜志，2009，24(5):534.

［3］ 周益芬，劉 峰，楊 蕾.HPLC測定鹽酸阿撲嗎啡舌下片的有關(guān)物質(zhì)［J］.華西藥學(xué)雜志，2009，24(4):419.

［4］ 戴向東，滕南雁，桑 彤.穿心蓮片含量測定(薄層色譜掃描法)的測量不確定度評定［J］.藥物分析雜志，2005，25(12):1556.

［5］ 王 玉，潘晞陵.藥品檢測中的片劑重量差異不確定度估算［J］.藥物分析雜志，2005，25(6):706.

［6］ 劉建萍.醋酸潑尼松片含量測定方法的探討［J］.西北藥學(xué)雜志，2005，20(5):F0003.

［7］ 姜文霞，李 靜，呂 毅.高效液相色譜法測定醋酸潑尼松片的含量［J］.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2003，25(3):160.