HPLC法測(cè)定維生素C片含量

蔣江云

(三明市藥品檢驗(yàn)所，福建三明365000)

維生素C是人體膠原蛋白形成所必需的，它有助于保持結(jié)締組織、骨樣組織以及牙本質(zhì)的完整，維生素C的缺乏可導(dǎo)致齒齦腫脹、出血，皮下淤點(diǎn)等，臨床中經(jīng)常需要給患者進(jìn)行維生素C補(bǔ)充和治療。維生素C片收載于《中國(guó)藥典》2010年版［1］，其含量測(cè)定采用碘量法。碘量法測(cè)定時(shí)在判斷滴定終點(diǎn)時(shí)可能產(chǎn)生人為的誤差，且新版藥典中碘滴定液的標(biāo)定改用硫代硫酸鈉反標(biāo)，增加了移液和判斷滴定終點(diǎn)的二重誤差。維生素C在含水介質(zhì)中，由于受光、空氣、溫度和pH影響，樣品溶液不穩(wěn)定使測(cè)定結(jié)果不理想。本文以二巰基丙烷磺酸鈉(DMPS)62.5 mg·mL－1為抗氧劑［2］，以磷酸鹽緩沖液pH(6.0±0.1)為溶劑，可使樣品處于初始狀態(tài)，建立HPLC法測(cè)定維生素C的含量。該方法操作簡(jiǎn)便，專(zhuān)屬性強(qiáng)，干擾少，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)用碘量法進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)兩種方法進(jìn)行比較，測(cè)定結(jié)果相近，說(shuō)明建立的HPLC法可作為維生素C片的含量測(cè)定和質(zhì)量控制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);色譜柱為 Hypersil ODS C18鍵合硅膠柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);Cary－50紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安); DELTA－320精密pH計(jì)(瑞士梅特勒一托利多酸度計(jì)); BP211D電子天平(德國(guó)賽多利斯);德國(guó)BRAND單道可調(diào)移液器(規(guī)格分別為20～200 μL、500～5 000 μL)。

1.2 試藥 維生素C對(duì)照品(中檢所，批號(hào):100425－200702，含量:100.0%，規(guī)格:100 mg，供含量測(cè)定用);維生素C片(福建省三明天泰有限公司，規(guī)格:100 mg/片，批號(hào)20111001，編號(hào)01);維生素C片(四川省三星堆制藥有限公司，規(guī)格:100 mg/片，批號(hào):110402，編號(hào)02);維生素C片(東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司，規(guī)格:100 mg/片，批號(hào): 100932，編號(hào)03);2，3－二巰基丙烷磺酸鈉(美國(guó)阿法埃莎，純度:95%);甲醇(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS C18柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm);流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鉀4 g與磷酸二氫鉀16 g，加煮沸過(guò)的冷水溶解并稀釋至2 000 mL，pH調(diào)節(jié)至6.0±0.1)－甲醇(95∶5);柱溫為室溫;流速為1.0 mL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng)266 nm;進(jìn)樣量20 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱(chēng)取維生素C對(duì)照品24.58 mg置25 mL棕色容量瓶，加DMPS溶液25 μL，用磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)溶解并稀至刻度，得約1 mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，避光保存。精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液各0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL分置100 mL棕色量瓶，各加入DMPS溶液100 μL，用磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)稀至刻度，得濃度分別約為5、10、15、20、25、30 μg·mL－1的溶液，分別取20 μL注入液相色譜儀，(Y)對(duì)相應(yīng)的濃度(X)進(jìn)行線性回歸，從而得到維生素C的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=99.984 5X－0.004 0(r=1.000 0，n=6)。結(jié)果表明維生素C進(jìn)樣量在5～30 μg·mL－1范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系，符合外標(biāo)法定量測(cè)定的要求。

2.3 供試品溶液的制備 取編號(hào)01的供試品20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取適量(約相當(dāng)于維生素C 50 mg)置50 mL棕色量瓶，加入DMPS溶液50 μL，用磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)溶解并稀至刻度，搖勻，即得約1 mg·mL－1的供試品溶液，濾過(guò);取續(xù)濾液2 mL置100 mL棕色量瓶，加入DMPS溶液100 μL，用磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)溶解并稀至刻度，搖勻，即得20 μg·mL－1的供試品溶液。

2.4 測(cè)定法 分別精密吸取濃度為20 μg·mL－1的對(duì)照品溶液、供試品溶液及依比例加入DMPS溶液的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)20 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，理論板數(shù)以維生素C的色譜峰計(jì)達(dá)6 700，符合液相色譜條件，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取25 μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定維生素C峰面積，結(jié)果維生素C峰面積的RSD為0.05%。

圖1 高效液相色譜圖

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品6份(樣品編號(hào)01)，照2.3項(xiàng)試驗(yàn)，平均含量為標(biāo)示量的100.39%，其RSD為0.62%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取20 μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在室溫條件下分別放置0、1、2、3、4、5、6、7 h后進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果維生素C峰面積的RSD為0.53%，表明供試品溶液在7 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密量取2.3中已知含量的供試品溶液(1 mg·mL－1)1 mL置100 mL棕色量瓶(樣品編號(hào)01，規(guī)格100 mg·片－1，含量為73.04%，平均片重0.138 3 g，稱(chēng)取0.074 40 g)，共9份，各加入DMPS溶液100 μL，按低、中、高濃度依次加入約1 mg·mL－1的維生素C標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.6、1.0、1.4 mL，每個(gè)濃度分別配制3份，以磷酸鹽緩沖液(pH 6.0± 0.1)為溶劑混合均勻。按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)測(cè)得量與加入量的比值來(lái)計(jì)算加樣回收率。結(jié)果其平均回收率為99.70%。

表1 回收率試驗(yàn)

2.9 樣品含量測(cè)定 依正文2.3及藥典方法測(cè)定三批樣品，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=4)(單位:%)

3 討論

溶劑的選擇。維生素C分子中的烯二醇基具有極強(qiáng)的還原性，其水溶液在空氣中極不穩(wěn)定，易被氧化為二酮基而成為去氫抗壞血酸。維生素C水溶液在弱酸性環(huán)境中穩(wěn)定性較好，經(jīng)選擇比較，以磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)為溶劑，加入水溶性抗氧劑二巰基丙烷磺酸鈉(DMPS)，其水溶液穩(wěn)定性提高。如以磷酸鹽緩沖液(pH 3.0±0.1)為溶劑，同樣加入上述抗氧劑，維生素C水溶液穩(wěn)定性稍差，且色譜圖中出現(xiàn)一個(gè)倒吸收的溶劑峰有時(shí)會(huì)干擾維生素C主峰的自動(dòng)積分，故不宜選擇。以磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)為溶劑，較以流動(dòng)相為溶劑穩(wěn)定性又更強(qiáng)。以2.1色譜條件測(cè)定，加入抗氧劑的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)無(wú)任何吸收峰，所選擇的溶劑對(duì)維生素C含量測(cè)定無(wú)干擾。實(shí)驗(yàn)中所配制的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)組分中分別含0.01 moL·L－1磷酸氫二鉀與0.06 moL·L－1磷酸二氫鉀，鹽含量相對(duì)較低，對(duì)色譜系統(tǒng)影響小。

測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。以磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)為空白，取加入抗氧劑DMPS溶液的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0± 0.1)在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，無(wú)吸收峰;取維生素C對(duì)照品適量，按比例加入適量的DMPS溶液，以磷酸鹽緩沖液(pH 6.0±0.1)配成濃度為10 μg·L－1的維生素C溶液，在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，維生素C在266 nm處有唯一的最大吸收，確定266 nm為本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)。

由于維生素C易氧化，配制磷酸鹽緩沖液時(shí)所用的蒸餾水要煮沸放冷后才能使用;維生素C見(jiàn)光不穩(wěn)定，須避光操作，用棕色容量瓶和樣品瓶，以提高該方法的準(zhǔn)確性。與傳統(tǒng)的滴定相比，該法靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于維生素C片含量的測(cè)定。

［1］ 杭太俊.藥物分析［M］.第7版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:536.

［2］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版(二部)［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.