巴馬小型豬大腸埃希菌的分離鑒定及耐藥性試驗(yàn)

陳克研，張 賀，陳振文，王 洋，王承利

（1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科，沈陽 110840；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)系，北京 100069）

巴馬小型豬源于廣西巴馬瑤族自治縣［1］，由于其體型小、遺傳性狀穩(wěn)定且在解剖學(xué)和生理生化等方面與人有較大的相似性，目前廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、皮膚病及消化系統(tǒng)疾病的外科手術(shù)及模型制作中［2，3］，而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)成功的前提。大腸埃希菌是近年來嚴(yán)重危害小型豬飼養(yǎng)的主要疾病之一［4］，由于其血清型較多，且對(duì)多數(shù)抗生素存在耐藥性，給該病的防治帶來一定的困難。本研究對(duì)疑似細(xì)菌感染的巴馬小型豬進(jìn)行檢測，確診為豬大腸埃希菌感染。此外，本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離的菌株耐藥性進(jìn)行分析，篩選出治療用特效藥物，為小型豬大腸埃希菌病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源：沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科于2012年3月先后從異地購進(jìn)巴馬小型豬20頭，在例行常規(guī)檢驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)3頭豬臨床表現(xiàn)異常，并伴隨腹瀉癥狀，立即用無菌棉拭子從這三頭豬的直腸處采集樣本，做進(jìn)一步分析。

1.1.2 主要試劑：美藍(lán)染液、革蘭染液、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、枸櫞酸鹽等試劑購自沈陽博洋生物技術(shù)有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL-2000均為TaKaRa公司產(chǎn)品；大腸埃希氏菌O型抗血清購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雌性昆明小鼠20只，體重12～25 g，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（軍）2007-001；使用許可證號(hào)： SYXK（軍）2007-001）。

1.2 方法

1.2.1 鏡檢：將棉拭子采集的直腸樣本直接涂抹到無菌蓋玻片上，按常規(guī)染色技術(shù)分別對(duì)其進(jìn)行美藍(lán)和革蘭染色，顯微鏡下油鏡觀察。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)：將棉拭子樣本用無菌 PBS （0.01 mol/L pH 7.4）處理后按1％的濃度接種普通肉湯培養(yǎng)基；37℃培養(yǎng)24 h后，用接種環(huán)粘取培養(yǎng)物，分別在麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線培養(yǎng)；37℃培養(yǎng)24 h后，挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡下油鏡觀察。

1.2.3 PCR鑒定：依據(jù)豬大腸埃希菌的毒力因子基因序列設(shè)計(jì)大腸埃希菌通用引物：上游 5＇-TCCTCAGCTATAGGGTGC-3＇，下游 5＇-ATCGAAAC AAGGCCAGTT-3＇；和大腸埃希菌特異性引物：上游5＇-CAGGTCGTCGTGTCTGCTAAA-3＇，下游 5＇-TCA GCGTGGTTGGATCAACCT-3＇，由華大基因公司合成；以分離的細(xì)菌為模板進(jìn)行PCR鑒定［5］。

1.2.4 生化試驗(yàn)：將分離的菌株分別接種葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、枸櫞酸鹽等微量糖發(fā)酵管，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果。

1.2.5 血清型鑒定：將16種大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)O型血清用石炭酸生理鹽水分別作4倍稀釋，吸取20 μL于無菌載玻片上，然后粘取加熱處理后的大腸埃希菌“O”抗原于血清中混勻；若有凝集顆粒出現(xiàn)判為陽性，若5 m in內(nèi)不出現(xiàn)凝集顆粒則為陰性。

1.2.6 致病性實(shí)驗(yàn)：取清潔級(jí)昆明小鼠20只，隨機(jī)分為4組，每組5只，腹腔注射分離的細(xì)菌，0.2 mL/只（約2×108CFU），第5組腹腔注射普通肉湯，做陰性對(duì)照；隔離飼養(yǎng)，逐日觀察。

1.2.7 病毒檢測：將采集的棉拭子樣本用無菌PBS （0.01 mol/L pH 7.4）制成乳懸液；用2％磷鎢酸負(fù)染，電鏡觀察是否有病毒粒子。

1.2.8 藥敏試驗(yàn)：將分離鑒定后的菌株接種普通肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液均勻涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基中；分別將頭孢他叮等25種抗生素紙片貼于平皿中；37℃培養(yǎng)24 h后觀察抑菌環(huán)大小。以上使用的25種藥物分別為：青霉素、鏈霉素、紅霉素、磷霉素、四環(huán)素、磺胺脒、利福平、慶大霉素、克拉霉素、呋喃妥因、新生霉素、美滿霉素、頭孢呋新、復(fù)方新諾明、氨芐青霉素、妥布霉素、左氟沙星、丁胺卡那霉素、頭孢他叮、乙基西梭霉素、先鋒必/舒巴坦、丙氟哌酸、磺胺嘧啶、菌必治、頭孢氨噻肟。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢

采集直腸棉拭子樣本觸片后經(jīng)美藍(lán)染色，可在鏡下見到明顯的短桿菌；革蘭染色后可見兩端鈍圓且顯紅色的革蘭陰性菌。

2.2 分離培養(yǎng)特性

采集的棉拭子經(jīng)無菌PBS處理后，接種普通肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后可見試管混濁且在底部存在不易分散的黏稠沉淀物；進(jìn)一步接種麥康凱培養(yǎng)基，有單一的磚紅色光滑菌落出現(xiàn)；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上則出現(xiàn)紫黑色帶金屬光澤的菌落落；分別挑取上述單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡下油鏡觀察，均為革蘭陰性的 短桿菌。

2.3 PCR鑒定結(jié)果

應(yīng)用PCR對(duì)3個(gè)樣本進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1所示，3個(gè)菌株分別經(jīng)大腸埃希菌通用引物及大腸埃希菌特異性引物PCR擴(kuò)增后，均可擴(kuò)增出1797 bp和750 bp的目的片段，初步判定為同一株大腸埃希菌。

2.4 生化試驗(yàn)結(jié)果

取3株分離菌的典型菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，3株細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果一致，均能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇及蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

圖1 PCR鑒定結(jié)果Fig.1 The identification results by PCR

表1 生化鑒定結(jié)果Tab.1 Result of biochemistry identify

2.5 血清型鑒定結(jié)果

使用豬大腸埃希菌O型抗血清對(duì)分離的3個(gè)菌株鑒定，結(jié)果3個(gè)菌株的血清型均為O138。

2.6 致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠在接種后12 h，表現(xiàn)畏光拱背；小鼠24 h后出現(xiàn)死亡，72 h后，小鼠全部發(fā)病，死亡率達(dá)60％；剖檢死亡小鼠可見脾臟腫大并伴有充血；無菌取心臟、肝臟和脾臟進(jìn)行觸片，染色鏡檢，同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，結(jié)果分離的細(xì)菌與巴馬小型豬病料中分離的一致，提示該菌株有一定的致病性。

2.7 病毒分離試驗(yàn)結(jié)果

病料經(jīng)電鏡觀察未發(fā)現(xiàn)有病毒樣粒子。

2.8 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

以抑菌環(huán)直徑大小作為對(duì)藥物敏感性的判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如表2所示，該菌株僅對(duì)青霉素、鏈霉素、頭孢曲松和呋喃妥因4種藥物敏感，對(duì)磷霉素、磺胺脒、左氟沙星等高度耐藥。

3 討論

大腸埃希菌是嚴(yán)重危害小型豬飼養(yǎng)的主要疾病之一，本文對(duì)10日齡左右的巴馬小型豬進(jìn)行檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)3頭豬表現(xiàn)異常，并伴有腹瀉?？剖胰藛T立即采集直腸樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，通過常規(guī)的美藍(lán)及革蘭染色，鏡下觀察確定其為革蘭陰性的短桿菌；將其接種麥康凱和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，其生長特征與大腸埃希菌一致的；進(jìn)一步通過PCR驗(yàn)證，初步判斷分離的細(xì)菌為大腸埃希菌。此外，由于病毒性疾病也容易伴發(fā)腹瀉癥狀，本文將采集的病料處理后通過電鏡觀察，未發(fā)現(xiàn)病毒粒子，從而排除病毒性疾病的可能。在臨床診斷時(shí)遇到異常癥狀，應(yīng)詳細(xì)收集臨床資料，了解病程綜合分析，查閱文獻(xiàn)后進(jìn)行鑒定。

目前，細(xì)菌性疾病大多應(yīng)用抗生素進(jìn)行治療，但由于細(xì)菌本身血清型較多，再加上臨床存在濫用抗生素的現(xiàn)象［7］，導(dǎo)致大多數(shù)菌株存在耐藥現(xiàn)象。李云龍［8］等對(duì)5種血清型大腸埃希菌進(jìn)行耐藥分析時(shí)發(fā)現(xiàn)各類型菌株的耐藥率最高達(dá)到96.8％。姜中其等［9］采用Kirby-Bauer法檢測60株大腸埃希菌，結(jié)果有57株呈耐藥譜型。本研究應(yīng)用25種抗菌藥物對(duì)分離的大腸埃希菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果僅青霉素、鏈霉素、頭孢曲松和呋喃妥因?qū)ζ涿舾?。由此可見，大腸埃希菌的耐藥性在臨床中普遍存在，在臨床用藥時(shí)應(yīng)先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選出高效敏感的藥物進(jìn)行治療。

目前，國外用于生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究用的小型豬大多在SPF級(jí)水平［10］，我國雖具有獨(dú)特的小型豬資源，但還未見成型的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在某種層面上影響了比較醫(yī)學(xué)資料的形成。因此，如何排除小型豬的病原體，保證小型豬相關(guān)研究的質(zhì)量，便顯得尤為重要。本研究通過細(xì)菌學(xué)檢測技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)分離鑒定出引起巴馬小型豬腹瀉的菌株為大腸埃希菌；進(jìn)一步通過藥敏實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)其敏感的特效藥物，一方面為小型豬疾病的發(fā)生和防治提供理論依據(jù)，另一方面為小型豬的生物進(jìn)化和種群建立奠定基礎(chǔ)。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Result of resistance test

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