血漿中APC基因甲基化檢測(cè)在早期肺癌診斷中的意義

賈紅珍

肺癌是目前全世界癌癥死因的第一名。1995年全世界有60萬(wàn)人死于肺癌，而且每年人數(shù)都在上升。本病多在40歲以上發(fā)病，而女性患肺癌的發(fā)生率上升趨勢(shì)更明顯，發(fā)病年齡高峰在60～79歲之間。男女患病率為2.3:1。以往研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中APC基因的啟動(dòng)子區(qū)會(huì)發(fā)生高甲基化，并且對(duì)肺癌診斷可能有一定的價(jià)值。腫瘤患者血漿中DNA含量增高，主要來(lái)源于腫瘤細(xì)胞，因此若在血漿DNA中也能檢測(cè)到這種甲基化改變，將有助于肺癌早期診斷。在本次研究中將對(duì)我院自2011年1月1日至2011年12月31日前來(lái)就診的31例肺癌患者給予臨床分析，從而探討血漿中APC基因甲基化檢測(cè)在早期肺癌診斷的臨床意義，為提高肺癌疾病的診斷率從而使患者得到及時(shí)治療以及提高患者生活與生存質(zhì)量提供可靠臨床依據(jù)，現(xiàn)結(jié)果如下。

資料與方法

1.一般資料:本文將對(duì)我院自2011年1月1日至2011年12月31日前來(lái)就診的31例肺癌患者給予臨床分析。31例肺癌患者作為研究組，其中男性患者為21例、女性患者為10例，年齡在29至71歲之間，平均為(52.1±1.3)歲;選取31例肺良性腫瘤患者作為對(duì)照組一，其中男性患者為19例、女性患者為12例，年齡在27至70歲之間，平均為(51.9±1.1)歲;選取31例健康人群為對(duì)照組二，其中男性為20例、女性為11例，年齡在28至71歲之間，平均為(52.0±1.2)歲。研究組、對(duì)照組一、對(duì)照組二患者在性別、年齡、教育背景以及社會(huì)經(jīng)歷等方面無(wú)顯著性差異，且P＞0.05，三組人群一般資料具有臨床可比性。

2.方法:研究組肺癌患者、對(duì)照組一肺部良性腫瘤患者以及對(duì)照組二健康人群分別進(jìn)行血漿中APC基因甲基化檢測(cè)，觀察并記錄三組人群檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出結(jié)論。

(1)樣本采集:對(duì)研究組、對(duì)照組一、對(duì)照組二患者分別采集EDTA－K2抗凝全血，采集量為2毫升，之后將所采集到的血液樣本進(jìn)行離心，選用每分鐘3000轉(zhuǎn)的離心速度持續(xù)離心十分鐘，分離血漿，之后對(duì)分離出的血漿采用每分鐘12000轉(zhuǎn)繼續(xù)離心十分鐘，將所得血漿置于零下70攝氏度保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)試劑及儀器:轉(zhuǎn)甲基試劑盒選用NEB公司生產(chǎn);DNA熱啟動(dòng)聚合酶為TaKaRa公司生產(chǎn);提取DNA選用磁珠法，使用上海浩源公司生產(chǎn)的相關(guān)試劑盒;選用MJ公司生產(chǎn)的PTC－100型號(hào)PCR擴(kuò)增儀;選用KoDak公司制造的凝膠成像系統(tǒng);選用美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的7500熒光定量基因擴(kuò)增儀;化學(xué)修飾試劑盒選用Chemicon公司生產(chǎn)。

(3)檢測(cè)方法:使用磁珠法對(duì)上述提取血漿進(jìn)行提取，具體操作步驟為血漿經(jīng)裂解液處理后，加入磁珠以及結(jié)合液，促進(jìn)血漿中DNA于磁珠表面吸附，吸附完成后使用磁體將磁珠從血漿中吸出，并使用洗液對(duì)磁珠進(jìn)行多次清洗，最后將清洗所得溶液使用洗脫液進(jìn)行DNA洗脫，將上清液吸出，上清液中所含物質(zhì)即為血漿中DNA。將上清液進(jìn)行化學(xué)修飾，之后使用實(shí)時(shí)熒光定量MSP進(jìn)行擴(kuò)增，即TaqMan探針，檢測(cè)APC基因甲基化，將結(jié)果設(shè)定為陽(yáng)性以及陰性兩種。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)于計(jì)量資料用(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

研究組肺癌患者、對(duì)照組一肺部良性腫瘤患者以及對(duì)照組二健康人群血漿中APC基因甲基化檢測(cè)結(jié)果對(duì)比分析，具體情況見(jiàn)表1。

表1 三組人群血漿中APC基因甲基化檢測(cè)結(jié)果對(duì)比分析

由表一可知，研究組肺癌患者體內(nèi)血漿中APC基因甲基化陽(yáng)性率為100.00%，明顯高于對(duì)照組一的3.23%以及對(duì)照組二的0.00%，且P＜0.05，三組人群對(duì)比結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;研究組肺癌患者體內(nèi)血漿中APC基因甲基化陰性率為0.00%，明顯低于對(duì)照組的96.77%以及對(duì)照組二的100.00%，且P＜0.05，三組人群對(duì)比結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討論

APC基因，全稱為adenomatous polyposis coli基因［1］，近年來(lái)隨著醫(yī)學(xué)水平的提高，該基因的染色體定位、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及基因序列均已經(jīng)明確［2］。研究發(fā)現(xiàn)［3］肺癌患者身體組織中APC基因的啟動(dòng)子區(qū)有高甲基化現(xiàn)象發(fā)生，因此能夠?yàn)榕R床診斷肺癌疾病提供可靠的依據(jù)，但肺癌患者血漿中的DNA含量有所增高，且此類DNA的主要來(lái)源是患者自身的腫瘤細(xì)胞［4］，因此肺癌患者血漿中若能夠檢測(cè)出APC基因發(fā)生甲基化改變，將更有助于早期肺癌患者的病情診斷。

本次研究所選用的肺癌患者均經(jīng)CT臨床醫(yī)學(xué)檢查可知其體內(nèi)含有肺部實(shí)體瘤，且肺部實(shí)體瘤直徑均小于2厘米，患者均進(jìn)行病理活檢，確診為肺癌患者，因此本文中研究組所有肺癌患者均為早期。經(jīng)本文研究可知，早期肺癌患者體內(nèi)血漿中APC基因甲基化陽(yáng)性率與肺部良性腫瘤患者及健康人群檢測(cè)結(jié)果具有明顯差異，因此可對(duì)患者進(jìn)行血漿中APC基因甲基化檢測(cè)，根據(jù)患者檢測(cè)結(jié)果對(duì)其病情進(jìn)行判斷，即血漿中APC基因甲基化檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則綜合患者臨床醫(yī)學(xué)影像檢查結(jié)果以及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果可判斷其為肺癌疾病。

綜上所述，對(duì)患者進(jìn)行血漿中APC基因甲基化檢測(cè)，能夠根據(jù)患者檢測(cè)結(jié)果，較為準(zhǔn)確的判斷患者是否患有肺癌疾病，使患者及時(shí)進(jìn)行治療，并制定具有針對(duì)性的治療方案，從而提高患者治療效果，提高患者生活質(zhì)量與生存率。

1 Gmnau C，Clark SJ，Rosenthal A.Bisulfite genomic sequencing:systematic Investigation of critical experimental parameters［J］.Nucleic Acids Res，2011，29(13):65.

2 潘世揚(yáng)，張寄南，魏源華，等.抑癌基因APC啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)及其在肺癌診斷中的應(yīng)用［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2004，22(6):415－418.

3 張麗霞，潘世揚(yáng)，謝而付，等.不同甲基化檢測(cè)技術(shù)對(duì)模擬肺癌患者血漿中APC基因甲基化的檢測(cè)［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2007，25(3):199－201.

4 Leon SA，Shapiro B，Sklaroff DM，et a1.Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy［J］.Cancer Res，1977，37(3):646－650.