針刺對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織EGF和bFGF表達的影響*

張毅敏， 唐純志， 程少冰， 陳愛連， 張玉卿

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，廣東廣州510632;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，廣東廣州510010)

創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是一個世界性的社會醫(yī)學(xué)問題，發(fā)生率為1‰［1－2］，已成為發(fā)達國家青少年傷病致死的首位病因。目前利用神經(jīng)干細胞修復(fù)顱腦損傷已成為國內(nèi)外生物及醫(yī)學(xué)研究的熱點［3］。內(nèi)源性神經(jīng)干細胞具有來源穩(wěn)定可靠、無倫理道德問題、無免疫排斥反應(yīng)、無致瘤性等優(yōu)勢，因此，尋找積極干預(yù)措施，充分調(diào)動內(nèi)源性神經(jīng)干細胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病已成為當(dāng)前新的研究熱點［4］。神經(jīng)干細胞的增殖分化受多種生長因子的調(diào)控，其中表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是對神經(jīng)干細胞的生長和增殖起關(guān)鍵作用的生長因子。大量臨床資料表明，針刺對腦損傷患者催醒及神經(jīng)功能恢復(fù)有顯著療效［5］，故本研究采用腦挫傷大鼠動物模型，觀察針刺對腦損傷后相關(guān)生長因子EGF和bFGF的影響，探討針刺促進神經(jīng)再生、治療腦損傷的可能作用機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠共30只，體重(280±30)g，鼠齡42 d，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號為0067955。本實驗在廣州中醫(yī)藥大學(xué)清潔級動物實驗室完成。

1.2 試劑與藥物 EGF和bFGF免疫組化檢測試劑盒(德國寶靈曼公司產(chǎn)品，購自武漢博士德生物工程有限公司)。針具為“華佗牌”一次性26號、1寸針灸針。

1.3 儀器 RM2025切片機(Leica)和EG1140H包埋機。Olympus BX50F－3雙目顯微鏡(附件自動照相裝置Nikon E990)。計算機圖像分析系統(tǒng)(GM－2000B生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，北京航天航空大學(xué)產(chǎn)品)。

2 方法

2.1 腦損傷模型建立 動物隨機分為3組:A組為假手術(shù)組，B組為模型組，C組為針刺組，每組10只。大鼠稱重后腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，麻醉成功后參照Feeney自由落體沖擊造模法［6］，沿顱骨正中線縱形切開頭皮，分離至顱骨，于矢狀縫左旁2 mm，冠狀縫后2 mm處，用牙科鉆鉆開顱骨，以此為中心，用蚊式血管鉗咬開直徑約4 mm圓形骨窗，深度至硬腦膜，保持硬腦膜完整。B、C組用致傷力度為25 g小錘從25 cm高度自由落下，打擊置于硬腦膜上的直徑為3 mm的圓柱體，造成左頂葉大腦皮質(zhì)局限性腦挫裂傷，然后將動物縫合頭皮。A組鉆孔后不打擊，直接縫合頭皮。

針刺組造模后24 h內(nèi)開始治療。針刺組穴位:百會、人中、風(fēng)府透啞門和合谷。將針刺入穴位2 mm，采用捻轉(zhuǎn)平補平瀉手法，每穴操作2 min。每天治療1次，共治療7次。假手術(shù)組及模型組不做治療。各組在相同條件下喂養(yǎng)。治療結(jié)束當(dāng)天取材，大鼠用10%的水合氯醛麻醉，斷頭取腦，4%中性多聚甲醛液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，沿挫傷灶中心作冠狀切片，片厚4 μm。

2.2 免疫組化法檢測EGF和bFGF 各組實驗大鼠腦組織切片經(jīng)純二甲苯脫蠟2次，每次6 min;梯度乙醇脫二甲苯各2 min;自來水漂洗、PBS漂洗各3次，每次2 min，加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下作用10 min;切片放入已沸騰的檸檬酸修復(fù)液中，繼續(xù)加熱至溶液冒小氣泡但不沸騰為度，保持10 min;停止加熱，冷卻至室溫約25 min，流水沖洗，PBS液洗2次，擦干切片組織周圍表面水分劃隔離圈;加入5%BSA封閉液，室溫下作用20 min;吸去血清，不洗分別直接滴加入對應(yīng)的(濃度1∶100)稀釋的第Ⅰ抗體兔抗(EGF、bFGF)100 μL/片，取1張切片滴加PBS作為陰性對照，37℃恒溫箱內(nèi)1 h;PBS沖洗，3 min×3次，滴加羊抗兔生物素化Ⅱ抗，100 μL/片37 ℃恒溫箱內(nèi) 20 min;PBS沖洗，3 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親合素100 μL/片，37℃恒溫箱內(nèi)20 min;PBS洗后滴加入DAB顯色液100 μL/片，顯色3～5 min;蘇木素淺復(fù)染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、分析結(jié)果。注意:操作過程中組織必須保持在濕潤狀態(tài)，不能干燥;所加試劑以完全覆蓋組織為度。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷:由病理?？漆t(yī)生在未知實驗分組情況下對所有標(biāo)本進行分析。在10×20倍光鏡下隨機觀察每一組動物同一部位切片，每張切片選擇5個不重復(fù)視野進行觀察，并采用全自動圖像分析系統(tǒng)測出每張切片內(nèi)腦組織EGF和bFGF的染色平均吸光度和染色面積率。陽性物質(zhì)在胞漿(膜上)內(nèi)呈棕黃色細顆粒狀，細胞核為淺藍色;陰性對照僅細胞核為淺藍色。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。組間比較:方差齊性時采用LSD檢驗，方差不齊時采用T3法檢驗。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 針刺對腦挫傷大鼠腦組織EGF表達的影響

模型組大鼠EGF平均吸光度值與陽性面積率較假手術(shù)組明顯降低(P＜0.01);針刺組EGF平均吸光度值與陽性面積率較模型組明顯升高(P＜0.01)，見圖1、表1。

2 針刺對腦挫傷大鼠腦組織bFGF表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠bFGF平均吸光度值升高((P＜0.01)，但陽性面積率無顯著差異(P ＞0.05);與模型組比較，針刺組bFGF平均吸光度值和陽性面積率均明顯升高(P ＜0.01)，見圖2、表2。

Figure 1.Expression of EGF protein in the cerebral cortex of rats in different groups(SABC staining，×200).A:sham －operated group;B:model group;C:acupuncture group.圖1 各組大鼠大腦皮質(zhì)EGF蛋白表達

表1 針刺對腦損傷大鼠腦組織EGF表達的影響Table 1.Effect of acupuncture on EGF expression in brain tissues of rats with traumatic brain injury(±s.n=10)

表1 針刺對腦損傷大鼠腦組織EGF表達的影響Table 1.Effect of acupuncture on EGF expression in brain tissues of rats with traumatic brain injury(±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs sham － operated group;▲▲P ＜0.01 vs model group.

Group Absorbance Rate of positive area Sham － operated 0.69 ±0.05 0.43 ±0.03 Model 0.34 ±0.31＊＊ 0.18 ±0.16＊＊Acupuncture 0.53 ±0.36＊＊▲▲ 0.29 ±0.22＊＊▲▲

表2 針刺對腦損傷大鼠腦組織bFGF表達的影響Table 2.Effect of acupuncture on bFGF expression in brain tissues of rats with traumatic brain injury(±s.n=10)

表2 針刺對腦損傷大鼠腦組織bFGF表達的影響Table 2.Effect of acupuncture on bFGF expression in brain tissues of rats with traumatic brain injury(±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs sham － operated group;▲▲P ＜0.01 vs model group.

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Figure 2.Expression of bFGF protein in the cerebral cortex of rats in different groups(SABC staining，×200).A:sham －operated group;B:model group;C:acupuncture group.圖2 各組大鼠大腦皮質(zhì)bFGF蛋白表達

討 論

神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)的增殖分化受多種生長因子的調(diào)控［7］，目前普遍認為EGF和bFGF等絲裂原信號在NSCs的生長和增殖起關(guān)鍵作用，均可維持NSCs的自我更新能力，其它細胞因子起協(xié)同作用［8］。bFGF是能夠促進NSCs或神經(jīng)前體細胞有絲分裂并具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的活性多肽，除通過FGFR－1傳遞有絲分裂信號外還通過其它受體起作用［9］。體外研究表明:EGF和 bFGF可以使NSCs在體外呈神經(jīng)球樣生長，并促進細胞分化，使未分化的神經(jīng)細胞向著生成神經(jīng)元的方向分化。但EGF與bFGF在NSCs增殖和分化中的作用存在一定差異:bFGF在胚胎發(fā)育早期具有維持神經(jīng)前體細胞生存和促進其增殖的作用，而EGF在發(fā)育晚期能促進神經(jīng)前體細胞增殖和分化;FGF－2主要促使向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化，而EGF誘導(dǎo)NSCs分化為膠質(zhì)細胞［10］。研究者在EGF灌注后立即檢測擴增細胞群的特征，發(fā)現(xiàn)95%以上的細胞呈EGF受體陽性和神經(jīng)上皮干細胞蛋白(nestin)陽性。停止EGF注射7周后，一部分細胞分化成為新的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞［11］。正常腦組織有基礎(chǔ)性bFGF表達，腦損傷后bFGF表達水平上調(diào)。Neary等［12］研究發(fā)現(xiàn)，bFGFmRNA表達在24 h時增強，3 d時達高峰，并持續(xù)到7 d。也有研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷能促進腦內(nèi)bFGF合成及分泌，刺激神經(jīng)干細胞的增殖，使缺血再灌注大鼠的nestin表達上調(diào)，從而發(fā)揮腦保護作用［13］。

本研究結(jié)果顯示，模型組損傷區(qū)腦組織EGF平均吸光度與陽性面積率均明顯降低，而bFGF平均吸光度值升高，這與以往的研究結(jié)果一致［12］，表明造模是成功的。針刺組EGF、bFGF均較模型組明顯升高(P＜0.01)，表明針刺能上調(diào)神經(jīng)再生相關(guān)生長因子EGF和bFGF的表達，加速損傷腦組織修復(fù)。我們的前期研究結(jié)論“針刺可促進神經(jīng)干細胞的增殖與分化”及“針刺可縮小腦損傷面積”均證明了這一點［14］。

綜上所述，針刺可促進神經(jīng)再生相關(guān)生長因子EGF和bFGF的表達，這可能是針刺促進神經(jīng)再生和功能恢復(fù)、治療顱腦損傷的機制之一。

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