iNOS－GC－cGMP信號活化參與了內毒素血癥大鼠血管低反應性的發(fā)生機制*

王海華， 閔志雪， 戚仁斌， 張根葆， 包鵬舉1，， 胡錢國1，， 孫 瑤

(皖南醫(yī)學院1生理教研室，2蛇毒研究所，安徽蕪湖241002;3暨南大學醫(yī)學院病理生理教研室，廣東 廣州510632)

膿毒癥是臨床上嚴重燒傷、休克及手術后患者重要并發(fā)癥之一，膿毒癥休克是重癥監(jiān)護病房(intensive care unit，ICU)患者死亡的主要原因，病死率高達30%～45%，嚴重的低血壓和血管麻痹導致一個或多個器官功能障礙［1－2］。研究表明，一氧化氮(nitric oxide，NO)的過量生成是導致敗血癥休克全身不可逆性低血壓的主要原因［3－4］。內源性一氧化氮主要是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化L－精氨酸生成的。給實驗動物注射純化的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)來模擬敗血癥休克是近年來國際上比較通用的有效手段［5－6］，LPS進入體內能刺激多種組織因子及血管活性物質過量表達，從而導致心血管功能障礙，但LPS引起的心血管功能障礙的機制至今尚未完全闡明。

臨床發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗生素對內毒素引起的炎癥無作用，多黏菌素B(polymyxin B，PMX－B)作為脂多糖的抑制劑，具有顯著抗內毒素作用［7］。本研究通過腹腔注射純化的LPS誘導大鼠內毒素血癥模型，探討LPS引發(fā)的內毒素血癥大鼠血管低反應性與誘導型NOS(inducible NOS，iNOS)－鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase，GC)－環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)信號活化的相關性，同時闡明PMXB在內毒素血癥大鼠血管低反應性的可能作用機制。

材料和方法

1 藥品和試劑

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、氨基胍(aminoguanidine，AMG)、乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)和亞甲藍(methylene blue，MB)均購自Sigma。去氧腎上腺素(phenylephrine，Phe)由上海禾豐制藥有限公司生產。TNF－α、NO和iNOS檢測試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。其余試劑均為國產分析純。

2 內毒素血癥大鼠模型復制

健康SD雄性大鼠(浙江省實驗動物中心提供)24只，動物質量合格證SCXK(浙)20080033，體重(220±20)g，適應性喂養(yǎng)1周，LPS(10 mg/kg，ip)建立內毒素血癥大鼠模型，腹腔注射LPS 2 h后，動物即表現(xiàn)出盤索成團、萎靡不振、腹瀉、活動度低下并伴有發(fā)紺、震顫等癥狀;4 h后血壓明顯下降，但動物沒有死亡，說明內毒素血癥模型復制成功。

3 實驗分組及處理

3.1 實驗分組 大鼠隨機分為4組:LPS組，LPS(10 mg/kg，ip，4 h);LPS+PMX －B 組(LPS+PMX －B 組)，LPS(10 mg/kg，ip，3.5 h)后從尾靜脈注射PMX－B(0.2 mg/kg)，余同 LPS組;PMX －B 組，腹腔注射生理鹽水3.5 h后從尾靜脈注射PMX－B(0.2 mg/kg)，余同LPS組;sham組，同時點均注射生理鹽水。1 h后進行大鼠血壓測定。

3.2 大鼠血壓測定 20%烏拉坦(5 mL·kg－1)腹腔注射麻醉大鼠后，取仰臥位固定于實驗臺，行頸總動脈插管術，通過壓力傳感器連接MedLab系統(tǒng)記錄平均動脈血壓(mean arterial blood pressure，MABP)，監(jiān)測時先穩(wěn)定20 min，再觀測30 min。然后頸總動脈采血2 mL，低溫超速離心后取上清液－20℃保存，留作后續(xù)生化指標檢測。

3.3 離體主動脈血管環(huán)標本的制備 采血后，迅速打開大鼠胸腔，取出胸腹段主動脈，置于4℃氧飽和的Krebs液中，清除血塊和血管周圍結締組織，Krebs液的成分為(mmol·L－1):NaCl 118.4，KCl 4.7，KH2PO41.18，MgSO4·7H2O 1.1，NaHCO34.5，CaCl22.25，glucose 11.1，pH 7.2 ～7.4。將血管均勻剪成約3 mm長的血管環(huán)，套入上下平行的2個不銹鋼鉤，通過張力換能器連接MedLab系統(tǒng)記錄張力變化。整個動脈環(huán)置入盛有10 mL Krebs液的37℃恒溫浴槽內，持續(xù)通以95%O2+5%CO2混和氣。先以0 g張力起步，平衡30 min后，逐步調節(jié)至最適初始張力1.5 g并平衡1 h，每15 min換液1次。以KCl 60 mmol·L－1收縮動脈環(huán)3次，直至收縮穩(wěn)定，以激發(fā)主動脈血管環(huán)最佳活性，當主動脈血管環(huán)對連續(xù)2次同樣的KCl刺激所引起的收縮幅度差別＜10%時，開始正式實驗。

3.4 主動脈血管環(huán)收縮與舒張功能的測定 采用累積給藥法，觀察間隔5 min累積給予1×10－8～1×10－5mol·L－1Phe誘導的主動脈血管環(huán)的收縮反應和1×10－8～1×10－4mol·L－1ACh誘導的主動脈血管環(huán)的舒張反應;分別用特異性iNOS抑制劑AMG(1×10－4mol·L－1)及 GC 抑制劑 MB(1 ×10－5mol·L－1)預處理主動脈血管環(huán)20 min后，觀察間隔5 min累積給予濃度為1 ×10－8～1 ×10－5mol·L－1Phe誘導的主動脈血管環(huán)的收縮反應。記錄主動脈血管環(huán)收縮幅度，并計算血管收縮率(vascular contraction rate，VCR)。血管收縮率(%)=(累加 Phe后的主動脈血管環(huán)收縮張力－最適初始張力)/空白組最大收縮張力平均值×100%。血管舒張率(%)=(加Phe后的主動脈血管環(huán)收縮張力－累加ACh后的血管張力)/(加Phe后的血管最大收縮張力－基礎血管張力)×100%。以上每一輪實驗完成后用K－H液反復沖洗3～5次，直至主動脈血管環(huán)張力恢復到實驗前的基礎水平才可以開始下一輪實驗。

3.5 生化指標檢測 使用UV－3200PCS紫外分光光度計檢測血漿中NO和iNOS;使用Model－680型酶標儀測定血清中TNF－α水平。

4 統(tǒng)計學處理

結 果

1 各組大鼠MABP變化

如圖1所示，同sham組相比，LPS組大鼠MABP顯著降低(P＜0.01)，PMX－B組大鼠MABP無明顯改變(P＞0.05);而LPS+PMX－B組大鼠MABP與LPS組相比顯著改善(P＜0.05)。

Figure 1.Changes of mean arterial blood pressure(MABP)in rats from different groups.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs sham group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs LPS group.圖1 各組大鼠平均動脈血壓的改變

2 離體主動脈血管環(huán)灌流實驗結果

2.1 主動脈血管環(huán)對Phe刺激的收縮反應和對ACh刺激的舒張反應 如圖2、3所示，同sham組相比，LPS組大鼠離體主動脈血管環(huán)對Phe刺激的收縮反應以及對ACh刺激的舒張反應均顯著降低(P＜0.01)，而PMX－B組無明顯變化(P＞0.05);同LPS組相比，LPS+PMX－B組大鼠離體主動脈血管環(huán)對Phe引起的收縮反應和ACh引起的最大舒張反應均顯著改善，只是部分恢復，仍低于 sham組(P＜0.05)。

Figure 2.Effects of phenylephrine on tension of the aorta rings of rats.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs LPS group.圖2 各組大鼠主動脈血管環(huán)對Phe刺激的收縮反應

Figure 3.Effects of acetylcholine on relaxation of the aorta rings of rats.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs LPS group.圖3 各組大鼠主動脈血管環(huán)對ACh刺激的舒張反應

2.2 用AMG(1×10－4mol·L－1)預處理后主動脈血管環(huán)對Phe刺激后張力的變化 表1顯示:通過AMG(1×10－4mol·L－1)預處理后相比較，各組主動脈血管環(huán)對1×10－7～1×10－5mol·L－1Phe誘導的收縮幅度均有升高;尤其在AMG預處理20 min前后LPS組大鼠主動脈血管環(huán)對1×10－5mol/L Phe引起的最大收縮幅度的差值 (54.17% ±7.92%)，明顯高于sham組和LPS+PMX－B組(P＜0.01);LPS+PMX－B組大鼠預處理前后差值與LPS組相比則明顯降低(P＜0.01);PMX－B組與sham組相 比無統(tǒng)計學意義(P＞0.01)。

表1 主動脈血管環(huán)經AMG預處理前后對Phe刺激的收縮反應Table 1.Effects of phenylephrine(10－8～10－5mol·L－1)on tension of the aorta rings of rat after pretreatment with AMG(1 ×10－4 mol·L－1)(%.±s.n=6)

表1 主動脈血管環(huán)經AMG預處理前后對Phe刺激的收縮反應Table 1.Effects of phenylephrine(10－8～10－5mol·L－1)on tension of the aorta rings of rat after pretreatment with AMG(1 ×10－4 mol·L－1)(%.±s.n=6)

＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham;△△P ＜0.01 vs LPS;pP ＜0.05，ppP ＜0.01 vs LPS+PMX －B;●P ＜0.05，●●P ＜0.01 vs PMX －B;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs sham+AMG;○P ＜0.05，○○P ＜0.01 vs LPS+AMG.

Phe(mol·L－1)10 －8 10－7 10 －6 10－5 Sham 14.74 ±3.79 67.21 ±16.39 91.26 ±13.38 101 Group.97 ±7.38 Sham+AMG 26.70 ±8.44* 82.36 ±23.84* 107.09 ±13.31＊＊ 123.75 ±19.34*LPS 5.99 ±2.59 21.38 ±8.20 35.81 ±8.26 39.19 ±9.05 LPS+AMG 17.15 ±8.41△△ 42.65 ±14.98△△## 68.43 ±13.37△△## 93.36 ±9.89△△##LPS+PMX － B 9.32 ±2.34 37.29 ±9.11 60.78 ±8.25 78.08 ±11.39 LPS+PMX － B+AMG 21.22 ±7.54p 65.83 ±14.69pp○ 87.65 ±13.37pp#○ 105.52 ±10.31pp#PMX － B 13.52 ±2.69 49.73 ±8.56 89.69 ±6.73 102.19 ±13.40 PMX －B+AMG 22.43 ±9.10● 75.97 ±19.31●○○ 105.09 ±19.70●○○ 121.88 ±13.20●●○○

2.3 用 MB(1 ×10－5mol·L－1)預處理后主動脈血管環(huán)對Phe刺激后張力的變化 表2顯示:通過MB(1 ×10－5mol·L－1)預處理 20 min 后相比較，各組主動脈血管環(huán)對 1×10－7～1×10－5mol·L－1Phe誘導的收縮幅度均有升高;從MB預處理前后比較，LPS+PMX－B組主動脈血管環(huán)對1×10－5mol/L Phe引起的最大收縮幅度的差值與sham組無顯著差異，均明顯低于LPS組(P＜0.01);PMX－B組與sham組相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表2 主動脈血管環(huán)經MB預處理前后對Phe刺激的收縮反應Table 2.Effects of phenylephrine(10－8～10－5mol·L－1)on tension of the aorta rings of rat after pretreatment with MB(1 ×10－5mol·L－1)(%.±s.n=6)

表2 主動脈血管環(huán)經MB預處理前后對Phe刺激的收縮反應Table 2.Effects of phenylephrine(10－8～10－5mol·L－1)on tension of the aorta rings of rat after pretreatment with MB(1 ×10－5mol·L－1)(%.±s.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs sham;△△P ＜0.01 vs LPS;ppP ＜0.01 vs LPS+PMX －B;●P ＜0.05，●●P ＜0.01 vs PMX －B;#P ＜0.05.##P ＜0.01 vs sham+MB;○P ＜0.05，○○P ＜0.01 vs LPS+MB.

Phe(mol·L－1)10 －8 10－7 10 －6 10－5 Sham 14.74 ±3.79 67.21 ±16.39 91.26 ±13.38 101 Group.97 ±7.38 Sham+MB 50.28 ±4.85＊＊ 103.16 ±12.62＊＊ 120.29 ±8.55＊＊ 140.17 ±7.61＊＊LPS 5.99 ±2.59 21.38 ±8.20 35.81 ±8.26 39.19 ±9.05 LPS+MB 45.04 ±9.45△△ 79.63 ±8.91△△## 97.36 ±10.09△△## 110.05 ±9.89△△##LPS+PMX － B 9.32 ±2.34 37.29 ±9.11 60.78 ±8.25 78.08 ±11.39 LPS+PMX － B+MB 51.70 ±5.42pp 92.61 ±10.93pp 110.89 ±13.31pp 129.02 ±17.09pp○○PMX － B 13.52 ±2.69 49.73 ±8.56 89.69 ±6.73 102.19 ±13.40 PMX －B+MB 55.80 ±8.06●●○ 81.30 ±17.64●# 106.15 ±16.10 134.29 ±16.47●●○○

3 生化指標檢測

表3顯示，LPS組大鼠血漿中iNOS濃度、NO含量及TNF－α水平較sham組明顯增高(P＜0.01);LPS+PMX－B組較LPS組降低明顯(P＜0.01);而PMX－B組與sham組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

討 論

敗血癥休克的主要特征之一是全身不可逆性低血壓。給實驗動物注射純化的LPS來模擬敗血癥休克是近年來國際上比較通用的有效手段［5－6］，LPS進入體內能刺激多種組織因子及血管活性物質過量表達，從而導致心血管功能障礙，表現(xiàn)為體循環(huán)血管舒張和對血管收縮劑反應性降低。NO的過量生成是導致敗血癥休克全身不可逆性低血壓的主要原因［3－4］。內源性NO主要是由一氧化氮合酶(NOS)催化L－精氨酸生成的。NO在敗血癥休克中起“雙刃劍”作用，適量的NO可引起血管舒張，降低血流阻力，抑制血小板聚集，防止小血管栓塞，增加心、腦等重要臟器的血流量，對機體有保護意義;但是NO過量產生會導致血管過度擴張，血管平滑肌對縮血管物質的反應性降低，造成全身不可逆性低血壓和循環(huán)衰竭。NO進入細胞后激活可溶性GC，使GTP轉變?yōu)閏GMP，激活蛋白激酶 G的活性增加［8］，而cGMP依賴性蛋白激酶使鈣內流減少，增加肌漿網鈣ATP酶對鈣的攝取或直接作用于收縮蛋白去磷酸化，從而產生舒血管作用［9］。NO是自由基，當形成OONO－時具有嚴重的細胞毒性作用［10］。

表3 大鼠血漿中NO、iNOS和TNF－α水平的變化Table 3.Changes of the plasma levels of NO，iNOS and TNF－α in rats of each group(±s.n=6)

表3 大鼠血漿中NO、iNOS和TNF－α水平的變化Table 3.Changes of the plasma levels of NO，iNOS and TNF－α in rats of each group(±s.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs LPS group.

Group NO(μmol·g－1protein)iNOS(103U·g－1protein)TNF－α(ng·L－1)Sham 4.09 ±0.58 521.90±111.95 304.32±17.40 PMX －B 5.43±1.66## 661.88±210.02## 318.99±21.10##LPS 15.41±3.24＊＊ 1 774.30±331.23＊＊ 450.64±29.98＊＊LPS+PMX －B 6.03±1.39## 783.79±107.13*## 332.74±30.06##

本實驗通過腹腔注射LPS復制大鼠內毒素血癥模型基礎上，整體觀察大鼠血壓及血清中NO、iNOS和TNF－α水平;同時結合離體血管灌流方法，利用Phe引發(fā)血管收縮的原理，旨在探討LPS誘發(fā)的內毒素血癥大鼠血管低反應性與iNOS－GC－cGMP信號活化的相關性，同時闡明PMX－B在內毒素血癥大鼠血管低反應性的可能作用機制。

多黏菌素(polymyxin)是發(fā)現(xiàn)于多黏桿菌(Bacillus polymyxa)培養(yǎng)液中的抗菌性多肽，具有表面活性，含有帶陽電荷的游離氨基，能與革蘭陰性菌細胞膜的磷脂中帶陰電荷的磷酸根結合，使細菌細胞膜面積擴大，通透性增加，細胞內的磷酸鹽、核苷酸等成份外漏，導致細菌死亡［11］。PMX－B具有顯著抗內毒素作用［7］。

實驗結果表明，LPS組大鼠MABP顯著降低，而LPS+PMX－B組大鼠MABP則改善明顯，與文獻報道一致［12］;LPS組大鼠血清中NO、iNOS以及TNF－α水平均顯著高于sham組;TNF－α是內毒素進入體內誘導機體效應細胞產生炎癥反應最重要的細胞因子之一，它與感染的嚴重程度以及內毒素血癥的預后密切相關。離體血管灌流實驗血管環(huán)張力結果顯示，LPS組血管環(huán)對Phe刺激的收縮反應量效曲線和對ACh的舒張反應量效曲線均顯著低于sham組;而LPS+PMX－B組大鼠血管環(huán)對Phe刺激的收縮反應和ACh的舒張反應均明顯恢復。研究表明，LPS在大鼠體內可誘導組織、細胞(包括血管內皮細胞和血管平滑肌細胞)產生大量的NO，后者可能通過多種途徑削弱血管平滑肌對縮血管物質的反應［4］。

有關Phe刺激血管環(huán)的收縮機制，是血管平滑肌細胞內的Ca2+水平升高所致，其主要來源于胞內鈣池釋放和胞外鈣的跨膜內流。胞內鈣池主要分為肌醇1，4，5－三磷酸敏感鈣池和ryanodine敏感鈣池，胞外鈣主要通過受體操縱性Ca2+通道(receptor－operated calcium channels，ROCCs)和電壓操縱性Ca2+通道(voltage－operated calcium channels，VOCCs)內流。實驗分別用特異性iNOS阻斷劑AMG和GC抑制劑MB預孵育血管環(huán)，結果發(fā)現(xiàn)各組大鼠主動脈血管環(huán)對Phe引起的收縮反應與孵育前比較均升高，尤其在AMG預處理20 min前后LPS組大鼠主動脈血管環(huán)對1×10－5mol/L的Phe引起的最大收縮幅度的差值 (54.17% ±7.92%)，明顯高于sham組和LPS+PMX－B組;這提示iNOS過量表達產生NO增多為導致血管低反應性的主要原因［13］。而GC抑制劑MB預處理20 min前后，LPS+PMX－B組主動脈血管環(huán)對1×10－5mol/L Phe引起的最大收縮幅度的差值與sham組無顯著差異，均明顯低于LPS組，這也說明PMX－B可能通過抑制iNOS－GC－cGMP信號活化，減少iNOS過量表達，從而改善內毒素血癥大鼠的血管低反應性［14］。

綜上所述，iNOS－GC－cGMP信號活化參與了內毒素血癥大鼠血管低反應性;多黏菌素B可以改善內毒素血癥大鼠血管低反應性。多黏菌素B對內毒素有滅活作用，從而使大鼠血清TNF－α水平降低，改善內毒素血癥大鼠血管的低反應性，抑制iNOS－GC－cGMP信號活化，減少iNOS過量表達，減少NO過量生成，從而改善內毒素血癥大鼠的血管低反應性;至于是否還有其它機制參與尚需進一步的深入研究。

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