大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜Treg/Th17平衡及TNF－α拮抗劑的影響*

陳瑞林， 陶 怡， 黃文輝， 呂志芬， 李 娟

(1南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院風(fēng)濕科，廣東廣州510515;2廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕科，廣東廣州510260)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞為特征的慢性炎癥性自身免疫?。?］。這種破壞性損傷是由免疫反應(yīng)和抗原非特異性炎癥過程引起的。RA的病因及發(fā)病機制尚不完全清楚，T細胞亞群異常在RA發(fā)病機制中起重要作用［2］。越來越多的證據(jù)表明，調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T-cells，Treg cells)和Th17細胞分化失衡可能在RA發(fā)病中占有重要地位［3］。但現(xiàn)有的大部分研究多關(guān)注RA外周血T細胞亞群失衡狀態(tài)，對于關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)Treg/Th17平衡，則很少報道。

本研究通過建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collageninduced arthritis，CIA)大鼠模型，研究Treg/Th17平衡在關(guān)節(jié)滑膜病變發(fā)生發(fā)展中的作用，并應(yīng)用腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)拮抗劑腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(TNFR-Fc)治療，探討TNFR-Fc對CIA關(guān)節(jié)滑膜Treg/Th17平衡的影響，以進一步闡明TNF-α拮抗劑治療的作用機制，并為更好地理解RA的發(fā)病機制、尋找更好的治療靶點提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康SPF級雌性Lewis大鼠30只，體重140～160 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 TNFR-Fc(由浙江海正藥業(yè)提供)，牛源性Ⅱ型膠原(Chondrex)，不完全弗氏佐劑(Chondrex)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA 試劑盒(R＆D)，兔抗大鼠 CD4多克隆抗體(Abbiotec)，大鼠叉頭框P3蛋白(forkhead box P3 protein，F(xiàn)oxp3)單克隆抗體(Biolegend)，大鼠轉(zhuǎn)錄因子維甲酸受體相關(guān)孤兒受體γt(retinoic acid receptor-related orphan receptor γt，RORγt)單克隆抗體(Abcam)，F(xiàn)ITC結(jié)合的抗兔IgG和rhodamine結(jié)合的抗鼠IgG(Sigma)。

2 方法

2.1 CIA大鼠模型的建立 按文獻［4］報道的建立CIA大鼠模型，簡述如下:將30只Lewis大鼠隨機分成正常對照組、CIA組、TNFR-Fc治療組。將牛源性Ⅱ型膠原和等體積不完全弗氏佐劑混合、乳化后，CIA組和TNFR-Fc治療組大鼠于尾根部及背部多點皮下注射0.4 mL，正常對照組大鼠皮下注射等量生理鹽水。7 d后加強免疫，第13 d TNFR-Fc治療組開始采用10 mg/kg TNFR-Fc腹腔注射，隔天1次;CIA組則予等量生理鹽水腹腔注射，隔天1次。

2.2 模型的鑒定及評估

2.2.1 關(guān)節(jié)炎的分級評估 每周1次評估大鼠關(guān)節(jié)腫脹和紅斑的出現(xiàn)情況。根據(jù)Wood法對關(guān)節(jié)炎的嚴重程度進行分級評估，評定依據(jù)為關(guān)節(jié)紅腫程度和范圍以及關(guān)節(jié)腫大和變性情況。0:正常;1:紅腫;2:腫脹;3:足趾畸形;4:踝部畸形，不能負重。每側(cè)關(guān)節(jié)最高4分，每只大鼠最高評分為16分。關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)=四肢關(guān)節(jié)評分之和。

2.2.2 關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)學(xué)檢查 造模后35 d處死大鼠，取后踝關(guān)節(jié)，置于10%甲醛溶液中固定24 h，經(jīng)脫鈣、脫水、透明、包埋等處理制成石蠟塊，室溫保存。切片，甲苯胺藍、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織學(xué)變化。

2.2.3 血漿TNF-α濃度檢測 心臟穿刺法取大鼠外周血2 mL，置于EDTA抗凝管中，離心，取上層血漿，-80℃保存;大鼠TNF-α ELISA試劑盒檢測各組大鼠血漿TNF-α濃度，操作步驟按說明書進行。

2.3 滑膜Foxp3和RORγt蛋白表達 應(yīng)用免疫熒光雙標染色法檢測。石蠟切片脫蠟，2%正常羊血清工作液封閉非特異性結(jié)合位點，37℃濕盒內(nèi)孵育60 min;離心去血清，予CD4多克隆抗體(1∶1 000)、Foxp3單克隆抗體/RORγt單克隆抗體(1∶500)依序孵育。磷酸緩沖液(PBS)沖洗后，切片予1∶50稀釋的FITC標記的抗兔IgG和1∶50稀釋的rhodamine標記的抗鼠IgG孵育。對照切片予正常兔血清和PBS來代替Ⅰ抗孵育。PBS沖洗后，AEC水性封片劑封片，在共聚焦顯微鏡(Leica SP2)下觀察，激發(fā)波長分別為488 nm和543 nm。細胞計數(shù)采用在400×鏡下計數(shù)形態(tài)完整的陽性細胞，6張切片/每只動物，每張切片鏡下統(tǒng)計200個細胞中的陽性細胞數(shù)量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，計量資料組間比較根據(jù)數(shù)據(jù)分布類型分別采用單因素方差分析和秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 模型的鑒定及評價

1.1 大鼠關(guān)節(jié)炎足爪評分 造模后CIA組大鼠平均第18 d出現(xiàn)明顯關(guān)節(jié)炎癥狀，后足首先出現(xiàn)紅腫，然后前足紅腫，隨時間延長，于21 d左右達到高峰，嚴重者不能負重，關(guān)節(jié)活動障礙，提示大鼠CIA模型建立成功。TNFR-Fc治療組大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎時間與模型組大致相似，高峰時間延遲至第28 d，且關(guān)節(jié)炎程度較CIA組顯著減輕(P＜0.01)，見圖1。對照組關(guān)節(jié)無異常改變。

Figure 1.The arthritis index of CIA rats.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs CIA.圖1 CIA組大鼠和TNFR－Fc治療組大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)

1.2 關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢查 病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，正常大鼠滑膜組織細胞排列規(guī)則，未見淋巴細胞及漿細胞的浸潤及軟骨染色缺失;CIA組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織呈重度增生，滑膜層變厚，排列紊亂，大量淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞浸潤，軟骨重度缺失;TNFR-Fc治療組HE染色滑膜增生及炎癥細胞浸潤較CIA組輕，見圖2。

1.3 血漿TNF-α濃度 ELISA結(jié)果顯示CIA組TNF-α較正常對照組及TNFR-Fc治療組顯著升高［CIA 組(713.33 ±145.83)ng/L vs TNFR-Fc治療組(67.62 ± 20.05)ng/L，正常對照組(24.86 ±3.12)ng/L］(P ＜0.01)，TNFR-Fc 治療組與正常對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖3。

Figure 2.The synovial pathological characteristic from various groups(HE staining，×400).圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理學(xué)HE染色

Figure 3.Plasma TNF-α level in rats from various groups.±s.n=6.＊＊P ＜ 0.01 vs control and TNFR-Fc treatment.圖3 三組大鼠血漿TNF－α水平

2 滑膜Foxp3和ROR－γt表達的比較

CD4被FITC標記為綠色熒光，F(xiàn)oxp3/RORγt被rhodamine標記為紅色熒光，共表達的部分呈黃色熒光。結(jié)果顯示Treg和Th17細胞主要分布在滑膜襯里細胞層及血管周圍;CIA組的CD4+Foxp3+Treg/CD4+細胞比例與正常對照組無明顯差異(23.12%±4.93%vs 24.66% ± 5.82%，n=6，P ＞ 0.05)，而TNFR-Fc治療組則升高明顯(33.07% ±5.14%);CIA組CD4+RORγt+Th17/CD4+細胞比例顯著增高(9.74% ± 2.23%vs 正常對照組 1.00% ± 0.59%，TNFR-Fc 治療組 5.63% ± 1.76%，n=6，P ＜0.01)，見圖 4、5。

討 論

RA是一種以慢性侵蝕性周圍關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病。CIA由Trentham等［5］于1977年創(chuàng)立，用Ⅱ型膠原免疫大鼠誘導(dǎo)多關(guān)節(jié)炎癥，由于其引起關(guān)節(jié)的癥狀和病理與 RA相似(滑膜增生、細胞浸潤、軟骨侵蝕、骨吸收和重塑)，被認為是人類RA的經(jīng)典動物模型，較廣泛地用于RA機制的研究以及RA藥物干預(yù)治療研究［6］。Lewis大鼠是制造CIA模型鼠的高度敏感鼠。本研究采用牛源性Ⅱ型膠原配合不完全弗氏佐劑成功誘導(dǎo)了CIA模型的發(fā)生。

既往認為 RA是Th1占優(yōu)勢的自身免疫病，但越來越多的研究結(jié)果提示Th1細胞可能在RA發(fā)病中并非占有主導(dǎo)地位［7-8］。Treg和Th17細胞的發(fā)現(xiàn)，彌補了Th1/Th2介導(dǎo)效應(yīng)機制的不足。Treg和Th17細胞雖同屬于CD4+T細胞，但生物學(xué)作用完全相反。IL-6和TGF-β等細胞因子作為關(guān)鍵因素決定著免疫應(yīng)答是Treg占主導(dǎo)地位，還是Th17占主導(dǎo)地位:在穩(wěn)定狀態(tài)或無炎癥損傷情況下，機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的TGF-β抑制著效應(yīng)T細胞的增殖，誘導(dǎo)初始T細胞向Treg分化;當(dāng)存在炎癥時，急性期蛋白IL-6大量產(chǎn)生，抑制了Treg的增殖，誘導(dǎo)初始T細胞向Th17分化［9］。對RA患者和動物模型的研究均表明Treg細胞在RA發(fā)病中有重要作用。在一些研究中已經(jīng)證實，早期RA患者的外周血中的CD4+CD25+Treg的數(shù)量比健康對照低［10-11］，可能正是因為這種細胞數(shù)量上的缺失，導(dǎo)致了免疫抑制功能的低下，給疾病的發(fā)生發(fā)展創(chuàng)造了條件。Lawson等［11］發(fā)現(xiàn)治療后病情控制良好的RA患者Treg水平與正常人則無明顯差別，說明RA病程及治療情況對Treg水平確實存在影響。Th17細胞主要分泌IL-17，還能分泌TNF-α、IL-21、IL-22和 IL-6;此外 IL-17可以和其它細胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ等相互作用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)RA患者關(guān)節(jié)滑液中 IL-17 的含量明顯升高［7］;動物實驗［12］初步結(jié)果顯示，在關(guān)節(jié)炎早期階段應(yīng)用中和性抗 IL-17抗體可以顯著減輕關(guān)節(jié)炎的嚴重程度，即使在關(guān)節(jié)炎的晚期階段抗 IL-17抗體仍然可以顯著減緩病程的發(fā)展。最近有研究報道［13］，隨著疾病活動性的增加，RA患者外周血CD4+T細胞中Th17細胞的比率增加而Foxp3+CD4+CD25+Treg細胞比率降低，導(dǎo)致Th17/Treg細胞比例失衡，并且平衡向Th17細胞一方偏移，提示RA患者體內(nèi)的免疫抑制效應(yīng)減弱而免疫炎性效應(yīng)增強，二者的共同作用可誘導(dǎo)外周血T細胞亞群的紊亂以及外周免疫耐受的破壞，進而促進疾病的發(fā)生發(fā)展。

Figure 4.CD4-Foxp3 lymphocytes in synovium stained by double immunofluorescent labeling and observed by confocal microscopy(×400).Arrows pointed out CD4+Foxp3+Treg cells.圖4 激光共聚焦顯微鏡下觀察免疫熒光雙染的滑膜中CD4－Foxp3淋巴細胞

Figure 5.CD4-RORγt lymphocytes in synovium stained by double immunofluorescent labeling and observed by confocal microscopy(×400).Arrows pointed out CD4+RORγt+Th17 cells.圖5 激光共聚焦顯微鏡下觀察免疫熒光雙染的滑膜中CD4－RORγt淋巴細胞

本研究采用激光共聚焦顯微鏡觀察CIA大鼠發(fā)病高峰期關(guān)節(jié)滑膜的Treg和Th17細胞，發(fā)現(xiàn) CIA大鼠滑膜增生明顯，Treg和Th17細胞主要分布在滑膜襯里細胞層及血管周圍;Th17細胞表達水平比正常大鼠明顯增多，而Treg細胞則與正常組相比無明顯差異，提示CIA大鼠病變關(guān)節(jié)滑膜存在Treg/Th17分化失衡，可能是由于Treg的功能受抑，Th17細胞誘導(dǎo)分化，而使得Th17細胞占主導(dǎo)地位。因此抑制Th17細胞分化，促進Treg細胞生成，誘導(dǎo)免疫耐受，重新建立體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)，可能是治療RA等自身免疫性疾病的新思路。

近年來將TNF-α拮抗劑用于治療活動性RA獲得成功，臨床試驗表明抗TNF-α治療不但能夠改善RA患者的癥狀和提高功能，而且可以有效控制病情的進展，這是RA臨床治療的一個飛躍［14］。但是TNF-α拮抗劑治療的作用機制還不完全清楚。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，抗TNF-α治療的機制不僅僅是阻斷TNF-α的促炎作用，還可減少關(guān)節(jié)滑膜及軟骨骨橋蛋白的表達［4］。而 TNF-α拮抗劑對CIA關(guān)節(jié)滑膜Treg/Th17分化的影響，未見系統(tǒng)報道。目前批準上市的TNF-α拮抗劑主要有3種，分別為TNFR-Fc(腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白)、Infliximab(TNF-α的人鼠嵌合、含25%鼠蛋白和75%人蛋白的IgG1單克隆抗體)和Adalimumab(重組全人源TNF-α IgG1單克隆抗體)。本研究使用TNFR-Fc治療CIA模型鼠后，TNFR-Fc治療組血漿TNF-α值較CIA組明顯降低，病理組織學(xué)評分亦顯示TNFR-Fc治療組關(guān)節(jié)及軟骨的病變較CIA組明顯輕。故TNFR-Fc對RA有較好的治療作用，可顯著減輕滑膜炎癥和抑制滑膜增生，與文獻報道結(jié)果一致。我們進一步觀察TNFR-Fc治療對關(guān)節(jié)滑膜Treg/Th17的影響，結(jié)果顯示TNFR-Fc治療組的Treg細胞顯著高于CIA組和正常對照組;而Th17細胞則比CIA組明顯減少，但高于正常對照組。有體外研究［15］結(jié)果認為TNFR-Fc并不能阻抑Th17細胞的誘導(dǎo)或恢復(fù)Treg細胞的生成，同時進行的CIA動物實驗結(jié)果顯示TNFR-Fc對外周Th17和Treg細胞沒有影響，認為TNFR-Fc對關(guān)節(jié)炎的治療作用與誘導(dǎo)Treg細胞無關(guān)。但與此相矛盾的研究報道比比皆是，如Ehrenstein等［16］報道的RA存在Treg細胞功能受損，抗TNF-α治療不但使其免疫抑制功能恢復(fù)，還使其數(shù)量增加;Ricciardelli等［17］研究發(fā)現(xiàn)，接受TNF-α拮抗劑治療的Crohn’s病患者與接受傳統(tǒng)治療方法的患者相比較，其腸道黏膜中的Foxp3+的細胞比例和Foxp3 mRNA的表達均顯著升高，提示抗TNF-α治療可能影響?zhàn)つふ{(diào)節(jié)性T細胞的活化和擴增;Notley等［18］進行的CIA動物實驗，采用流式細胞術(shù)檢測Th17細胞，結(jié)果則顯示TNFR-Fc導(dǎo)致外周血Th17細胞擴增，但關(guān)節(jié)滑液的Th17細胞卻明顯減少，推測可能是因為TNFR-Fc抑制Th17細胞聚集于關(guān)節(jié)。我們的研究結(jié)果與之相似，不同的是我們同時檢測關(guān)節(jié)滑膜Treg/Th17細胞的變化，而且采用激光共聚焦顯微鏡更直觀地觀察病變關(guān)節(jié)滑膜Treg/Th17細胞的定位，排除自發(fā)熒光、成團細胞或細胞碎片的干擾;但缺點是觀察細胞數(shù)目有限，存在主觀因素影響。我們的研究結(jié)果提示CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜的Treg細胞數(shù)量沒有明顯減少，但可能存在功能受抑，Th17細胞增多，病變關(guān)節(jié)滑膜存在Treg/Th17分化失衡;TNFR-Fc可能通過抑制關(guān)節(jié)滑膜Th17細胞分化，誘導(dǎo)Treg細胞生成/聚集，使得病變關(guān)節(jié)的Treg/Th17平衡得以恢復(fù)，從而打破炎性瀑布的環(huán)路，恢復(fù)機體免疫耐受功能而緩解病情。

［1］謝建民，王好問，陸才生.TNF-α上調(diào)單核巨噬細胞MMP-9的活性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)破壞的關(guān)系［J］.中國病理生理雜志，2009，25(6):1181-1185.

［2］陳瑞林，陶 怡，黃文輝.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎CD4+CD28-T細胞與淋巴細胞凋亡的相關(guān)性研究［J］.中國病理生理雜志，2010，26(9):1824-1827.

［3］Nistala K，Wedderburn LR.Th17 and regulatory T cells:rebalancing pro-and anti-inflammatory forces in autoimmune arthritis［J］.Rheumatology(Oxford)，2009，48(6):602-606.

［4］呂志芬.sTNFR-Fc在CIA模型鼠中的療效觀察及其對OPN的影響［D］.廣州:廣州醫(yī)學(xué)院，2010.

［5］Trentham DE，Townes AS，Kang AH.Autoimmunity to type II collagen:an experimental model of arthritis［J］.J Exp Med，1977，146(3):857-868.

［6］Brand DD，Latham KA，Rosloniec EF.Collagen-induced arthritis［J］.Nat Protoc，2007，2(5):1269-1275.

［7］McInnes IB，Schett G.Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis［J］.Nat Rev Immunol，2007，7(6):429-442.

［8］Bettelli E，Oukka M，Kuchroo VK.TH-17 cells in the circle of immunity and autoimmunity［J］.Nat Immunol，2007，8(4):345-350.

［9］Bettelli E，Carrier Y，Gao W，et al.Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells［J］.Nature，2006，441(7090):235-238.

［10］van Amelsfort JM，Jacobs KM，Bijlsma JW，et al.CD4+CD25+regulatory T cells in rheumatoid arthritis:differences in the presence，phenotype，and function between peripheral blood and synovial fluid［J］.Arthritis Rheum，2004，50(9):2775-2785.

［11］Lawson CA，Brown AK，Bejarano V，et al.Early rheumatoid arthritis is associated with a deficit in the CD4+CD25highregulatory T cell population in peripheral blood［J］.Rheumatology(Oxford)，2006，45(10):1210-1217.

［12］Bush KA，F(xiàn)armer KM，Walker JS，et al.Reduction of joint inflammation and bone erosion in rat adjuvant arthritis by treatment with interleukin-17 receptor IgG1 Fc fusion protein［J］.Arthritis Rheum，2002，46(3):802-805.

［13］牛 倩，黃卓春，蔡 蓓，等.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血Th17/Treg細胞比率失衡的研究［J］.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2010，26(3):267-272.

［14］Klareskog L，van der Heijde D，de Jager JP，et al.Therapeutic effect of the combination of etanercept and methotrexate compared with each treatment alone in patients with rheumatoid arthritis:double-blind randomised controlled trial［J］.Lancet，2004，363(9410):675-681.

［15］Fujimoto M，Serada S，Mihara M，et al.Interleukin-6 blockade suppresses autoimmune arthritis in mice by the inhibition of inflammatory Th17 responses［J］.Arthritis Rheum，2008，58(12):3710-3719.

［16］Ehrenstein MR，Evans JG，Singh A，et al.Compromised function of regulatory T cells in rheumatoid arthritis and reversal by anti-TNFα therapy［J］.J Exp Med，2004，200(3):277-285.

［17］Ricciardelli I，Lindley KJ，Londei M，et al.Anti tumour necrosis-α therapy increases the number of FOXP3+regulatory T cells in children affected by Crohn's disease［J］.Immunology，2008，125(2):178-183.

［18］Notley CA，Inglis JJ，Alzabin S，et al.Blockade of tumor necrosis factor in collagen-induced arthritis reveals a novel immunoregulatory pathway for Th1 and Th17 cells［J］.J Exp Med，2008，205(11):2491-2497.