尿毒癥患者外周Th17/Treg細(xì)胞變化與機(jī)體微炎癥狀態(tài)的關(guān)系*

劉璠娜， 董向楠， 胡 波， 管保章， 孟 宇， 馮艷艷， 尹良紅

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東廣州510632)

近來研究認(rèn)為，尿毒癥不但是機(jī)體針對(duì)腎功能進(jìn)行性衰竭所產(chǎn)生的一系列復(fù)雜的細(xì)胞、生物化學(xué)反應(yīng)，同時(shí)還是一個(gè)以細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)為特征的全身性慢性微炎癥狀態(tài)。微炎癥狀態(tài)導(dǎo)致患者免疫能力差，容易合并各種并發(fā)癥。輔助性T細(xì)胞17(T－h(huán)elper 17 cells，Th17)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新型Th細(xì)胞亞群，其介導(dǎo)炎性反應(yīng)，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)是能夠抑制免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，能夠下調(diào)免疫反應(yīng)，從而降低對(duì)病原體的控制能力。Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞通過細(xì)胞因子的作用相互轉(zhuǎn)換，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫抑制與免疫效應(yīng)并使之處于精細(xì)而復(fù)雜的動(dòng)態(tài)平衡中［1］。Th17/Treg保持平衡，有利于機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的維持，如果Th17/Treg失平衡就會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生乃至惡化。

維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(retinoid－related orphan receptor γt，RORγt)是核激素受體之一，是Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子［2－3］。叉頭框 P3蛋白(forkhead box P3 protein，F(xiàn)oxp3)特異性高表達(dá)于CD4+CD25+T細(xì)胞，是 Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子［4］，可反映 Treg細(xì)胞的活性水平。通過檢測(cè)Foxp3和RORγt mRNA的表達(dá)量，可以推斷Th17和Treg細(xì)胞水平的變化。因此，本研究擬通過對(duì)尿毒癥患者外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的分析，進(jìn)一步探討尿毒癥中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的變化及其平衡在尿毒癥患者微炎癥狀態(tài)中的臨床意義。

材料和方法

1 研究對(duì)象

選擇2010年7月～2011年7月在我院診斷為尿毒癥的患者30例，男18例，女12例，平均年齡(53.0±5.7)歲，原發(fā)病為慢性腎炎及高血壓腎病，腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate，GFR)＜15 mL/min;其中維持性血液透析(maintaining hemodialysis，MHD組)患者20例，未接受透析治療(chronic kidney disease，CKD組)10例。對(duì)照組(control組)20 例，男11 例，女9 例，平均年齡(45.0 ±5.7)歲，均為健康志愿者，無(wú)免疫相關(guān)性疾病，近期無(wú)感染及腎臟疾病。全部對(duì)象空腹抽取靜脈血，肝素抗凝，標(biāo)本于采集后6 h內(nèi)處理、分析。

2 方法

2.1 標(biāo)本收集 各組患者均于清晨，空腹，平臥位，抽取靜脈血5～10 mL，分別裝于EDTA抗凝管和促凝管中。透析患者于透析前采血。

2.2 轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3 mRNA的表達(dá) 上述標(biāo)本與PBS緩沖液以1∶1比例混合后，小心加入1 mL的淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，并提取RNA，將溶解的RNA取2 μL于Take3板上，放于酶標(biāo)儀中測(cè)A值(即260 nm與280 nm波長(zhǎng)比值)，選取A值為1.8～2.0的RNA于－80℃?zhèn)溆?。按一定比例配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，并在PCR儀上反轉(zhuǎn)錄。然后在NCBI上搜索RORγt和Foxp3對(duì)應(yīng)的cDNA序列，用軟件Primer Premier 5分析引物，進(jìn)行設(shè)計(jì)，然后將設(shè)計(jì)好的引物與NCBI中的BLAST中進(jìn)行驗(yàn)證，然后由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行引物合成。引物序列為:

RORγt正義鏈 5'－ CCTGGGCTCCTCGCCTGACC－3'，反義鏈 5'－TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC －3';Foxp3正義鏈5'－CTGACCAAGGCTTCATCTGTG－3'，反義鏈 5'－ACTCTGGGAATGTGCTGTTTC －3';β－actin正義鏈 5'－CACGAAACTACCTTCAACTCC－3'，反義鏈5'－CATACTCCTGCTTGCTGATC －3'。

然后稀釋引物，并進(jìn)行PCR反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物與6×Buffer的緩沖液混勻后(比例為5∶1混勻)加入瓊脂糖凝膠內(nèi)跑電泳，20 min后取出凝膠，在紫外觀察燈下觀察，GSM凝膠圖像分析管理系統(tǒng)拍照，Image－Pro Plus圖像處理系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析。

2.3 血清細(xì)胞因子的測(cè)定 促凝管收集血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)白細(xì)胞介素－6(interleukin－6，IL－6)、IL－10和IL－17檢測(cè)步驟，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)450 nm處的A值。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中的IL－6、IL－10和IL－17的濃度。用免疫透射比濁法測(cè)定炎癥標(biāo)志物高敏C反應(yīng)蛋白(high－sensitivity C－reactive protein，hs－CRP)濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3的mRNA表達(dá)情況

RORγt與 Foxp3 mRNA分別是 Th17與Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，通過其表達(dá)量可以推測(cè)出Th17與Treg細(xì)胞的含量。如表1所示，尿毒癥組與正常對(duì)照組相比，RORγt mRNA表達(dá)量較高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但是，CKD組與 MHD組相比，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。相反，尿毒癥組與正常對(duì)照組相比，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)量低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但CKD組與MHD組相比Foxp3表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RORγt/Foxp3比值間接反應(yīng)Th17/Treg細(xì)胞比例，由表1可以看出，與正常對(duì)照組相比，尿毒癥患者RORγt/Foxp3比值較高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而尿毒癥患者組，透析與未透析患者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 各組間胞因子的比較

IL－6、IL－17與hs－CRP含量在尿毒癥組較高，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2;而IL－10含量與正常對(duì)照組相比則較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IL－10、IL－17及 hs－CRP在CKD組的含量較MHD組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而IL－6含量在CKD組和MHD組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組患者RORγt及Foxp3的表達(dá)及RORγt/Foxp3的比值Table 1.The expression of RORγt and Foxp3 and ratio of RORγt to Foxp3 in different groups(±s)

表1 各組患者RORγt及Foxp3的表達(dá)及RORγt/Foxp3的比值Table 1.The expression of RORγt and Foxp3 and ratio of RORγt to Foxp3 in different groups(±s)

*P ＜0.05 vs control group.

Group n RORγt/β －actin Foxp3/β －actin RORγt/Foxp3 Control 20 4.55 ±1.31 13.08 ±3.93 0.35 ±0.12 CKD 10 18.38 ±3.13* 7.96 ±2.24* 2.31 ±0.89*MHD 20 19.17 ±2.40* 8.54 ±3.35* 2.49 ±0.34*

表2 各組患者細(xì)胞因子濃度Table 2.The concentration of serum cytokines in different groups(±s)

表2 各組患者細(xì)胞因子濃度Table 2.The concentration of serum cytokines in different groups(±s)

*P ＜0.05 vs control group;▲P ＜0.05 vs MHD group

Group n IL－10(ng/L) IL－6(ng/L) IL－17(ng/L) hs－CRP(mg/L)Control 20 20.02 ±5.98 20.02 ±5.98 14.97 ±6.921.69 ±0.57 CKD 10 10.21 ±3.20* 27.56 ±7.27* 28.34 ±11.28* 3.28 ±1.24*MHD 20 12.14 ±4.21＊▲ 26.90 ±10.10* 31.92 ±15.29＊▲ 4.29 ±1.85＊▲

3 轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3與細(xì)胞因子相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示:hs－CRP水平隨RORγt/βactin增加而增加，且呈線性趨勢(shì)，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.776，P ＜0.05。而 hs－ CRP 水平隨 Foxp3/β －actin增加而減少，且呈線性趨勢(shì)，Pearson相關(guān)系數(shù)r= －0.685，P ＜0.05。

討 論

尿毒癥患者的微炎癥狀態(tài)不僅僅限于一般意義上的感染，是微觀層面上通過檢查血中的相關(guān)物質(zhì)而明確的，具有持續(xù)性和間斷性的特點(diǎn)。炎癥反應(yīng)可以引起機(jī)體行為、生理、生化及營(yíng)養(yǎng)狀況等多方面的改變。在尿毒癥患者營(yíng)養(yǎng)不良、炎癥、心腦血管動(dòng)脈粥樣硬化等的一系列惡性循環(huán)中起著核心作用［5］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道:透析人群中處于微炎癥狀態(tài)的患者可達(dá)30%～50%［6］。故及早發(fā)現(xiàn)處于微炎癥狀態(tài)的患者并對(duì)其進(jìn)行提早干預(yù)治療是改善此類患者預(yù)后的一項(xiàng)極其必要的舉措。

Treg作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，具有誘導(dǎo)免疫耐受，維持體內(nèi)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。免疫抑制性是Treg細(xì)胞的最重要特性，能抑制效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞增生與活化［7］。Th17細(xì)胞介導(dǎo)炎性反應(yīng)，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答［8］，Treg與Th17細(xì)胞保持平衡有利于機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的維持［9］。Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞之間的平衡狀態(tài)被打破是很多炎癥反應(yīng)與自身免疫性疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素［10］。

我們的研究表明，尿毒癥患者的RORγt/Foxp3的比值明顯高于健康志愿者，而CKD與MHD組無(wú)明顯差異。這說明在尿毒癥患者外周血中Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比例增高，Treg細(xì)胞減少。由于Treg細(xì)胞下調(diào)，免疫抑制功能下降，導(dǎo)致效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞大量活化，產(chǎn)生大量致炎因子，導(dǎo)致透析患者免疫功能紊亂，Th17細(xì)胞數(shù)也隨之減少。Th17細(xì)胞表達(dá)水平過低，從而導(dǎo)致機(jī)體抵抗外來病原菌感染的能力下降，但Th17細(xì)胞過度表達(dá)可能引發(fā)炎性反應(yīng)和自主免疫反應(yīng)。提高尿毒癥患者外周血Treg的水平，將有助于改善該患者的免疫功能。

hs－CRP是反映微炎癥狀態(tài)的最敏感指標(biāo)，hs－CRP超過正常即可確診為微炎癥狀態(tài)［11］。我們的研究表明:入選的尿毒癥患者存在微炎癥狀態(tài)，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn) hs－CRP與 RORγt存在正相關(guān)，而與Foxp3存在負(fù)相關(guān)，并且能與hs－CRP共同反映患者體內(nèi)是否存在微炎癥狀態(tài)的IL－10與IL－17也都出現(xiàn)相應(yīng)的變化。反應(yīng)Treg細(xì)胞的細(xì)胞因子IL－10明顯減低;而反應(yīng)Th17細(xì)胞的細(xì)胞因子IL－17明顯增高。尿毒癥患者體內(nèi)Th17細(xì)胞，IL－6和IL－17升高，而Treg細(xì)胞，IL－10降低，這可能是因?yàn)槟蚨景Y患者體內(nèi)免疫平衡向促炎細(xì)胞方向傾斜，導(dǎo)致患者體內(nèi)微炎癥狀態(tài)的進(jìn)一步加劇。而微炎癥狀態(tài)中IL－6等促炎細(xì)胞因子也能使Treg細(xì)胞向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化，更加劇了這兩種細(xì)胞發(fā)展的不平衡，引起了患者體內(nèi)免疫功能的紊亂。這從另一個(gè)側(cè)面說明尿毒癥患者的微炎癥狀態(tài)與Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的不平衡性相關(guān)。

綜上所述，Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞發(fā)展的不平衡性在尿毒癥患者的微炎癥狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。這種不平衡性一方面使免疫系統(tǒng)激活，另一方面免疫效應(yīng)不足，這種雙向變化，進(jìn)一步加劇了炎癥反應(yīng)，加劇了患者微炎癥狀態(tài)的發(fā)展。這提示:抑制Th17細(xì)胞的活化并增強(qiáng)Treg細(xì)胞的活性，調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞的平衡，可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)，抑制微炎癥狀態(tài)的進(jìn)展，從而為尿毒癥及維持性血液透析患者相關(guān)并發(fā)癥的治療提供了新的思路。

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