肝素通過(guò)TLR4減少脂多糖刺激的人內(nèi)皮細(xì)胞IL－8表達(dá)*

李 旭， 李 鑫， 馬曉春

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧沈陽(yáng)110001)

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁外膜的一種成分，是導(dǎo)致膿毒癥的主要因素［1］。LPS從細(xì)菌細(xì)胞膜脫落，與脂多糖連接蛋白(lipopolysaccharide－binding protein，LBP)相結(jié)合，連接到可溶型或膜型白細(xì)胞分化抗原(cluste of differentiation，CD)14，從而將其轉(zhuǎn)運(yùn)至 LPS/Toll樣受體4(Toll－like receptor 4，TLR4)復(fù)合物，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，如腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF－ α)，白細(xì)胞介素1β(interleukin－1β，IL－1β)、IL－6和IL－8，進(jìn)而發(fā)生一系列炎癥反應(yīng)［2］。IL－8是一種典型的趨化因子，屬于CXC類趨化性細(xì)胞因子家族，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等也可以產(chǎn)生［3］。IL－8的主要功能是在炎癥過(guò)程中促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集、游走、趨化至炎癥部位，釋放多種炎癥介質(zhì)，引起炎癥反應(yīng)和組織損傷，在膿毒癥過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3］。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明內(nèi)皮細(xì)胞在LPS引起的膿毒癥多器官功能障礙等病理過(guò)程中起到關(guān)鍵作用［4］。內(nèi)皮細(xì)胞是機(jī)體的主要炎癥反應(yīng)細(xì)胞，亦是LPS作用的靶細(xì)胞，它們襯覆于血管內(nèi)壁構(gòu)成血管通透性的主要屏障，能合成和分泌調(diào)節(jié)凝血－纖溶系統(tǒng)的物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管張力的因子以及細(xì)胞因子等，從而在創(chuàng)傷愈合及炎癥反應(yīng)中起到重要作用［5］。肝素(普通肝素，或稱未分級(jí)肝素，unfractionated heparin，UFH)在臨床應(yīng)用中降低膿毒癥患者發(fā)生彌散性血管內(nèi)凝血、急性腎衰竭和多器官功能障礙的比率，并降低28 d病死率［6］，但具體機(jī)制并不清楚，因此，本研究旨在探討肝素對(duì)脂多糖刺激人內(nèi)皮細(xì)胞IL－8水平的影響，并研究TLR4可能的影響，尋求肝素在臨床膿毒癥患者中應(yīng)用的理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞株(HPMECs)購(gòu)自上海拜力生物技術(shù)有限公司;胎牛血清(HyClone);DMEM培養(yǎng)基(HyClone);LPS(O55∶B5，Sigma);Trizol(Invitrogen);TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程公司);人 IL－8 ELISA試劑盒購(gòu)于R＆D。其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HPMECs細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1～2 d換液1次。

2.2 細(xì)胞處理及分組 按照1×109cells/L密度將HPMECs接種于6孔板，每孔2 mL。實(shí)驗(yàn)分為4組:正常對(duì)照組、LPS刺激組、LPS+普通肝素100 U/L組和LPS+普通肝素103U/L組。肝素作用組提前15 min應(yīng)用既定濃度肝素，后加入10 mg/L濃度的LPS刺激;正常對(duì)照組應(yīng)用相同劑量PBS。各組分別在培養(yǎng)2、6和12 h后收集細(xì)胞上清，測(cè)定上清中IL－8水平。于2、6和12 h收集細(xì)胞提取RNA，于－80℃保存。

2.3 細(xì)胞上清中IL－8水平測(cè)定 各組細(xì)胞分別在LPS作用2、6和12 h收集細(xì)胞上清，4 000 r/min離心20 min去除細(xì)胞碎屑，應(yīng)用ELISA方法分析上清中IL－8的表達(dá)。操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每組樣本作3個(gè)復(fù)孔。

2.4 IL－8、CD14和 TLR4 mRNA表達(dá)測(cè)定 應(yīng)用 Trizol提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和純度。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用real－time PCR測(cè)定。反應(yīng)總體積:25 μL，加入 cDNA 2 μL。IL －8:上游引物 5’－CAC CGG AAG GAA CCA TCT CA －3’，下游引物5’－AGA GCC ACG GCC AGC TT －3’，各 1 μL，反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。CD14:上游引物5’－CCC TAG CGC TCC GAG ATG －3’，下游引物 5’－GAA CGA CAG ATT GAG GGA GTT CA －3’，各1 μL，反應(yīng)條件:95℃ 30 s，95 ℃ 5 s，52 ℃ 45 s，35 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。TLR4:上游引物CCG AAG CCT TGG CGT TCT，下游引物 TCC CGG TAG TAC AGG CAG ATG，各1 μL，反應(yīng)條件:94 ℃ 50 s，94 ℃ 5 s，72℃ 50 s，30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。選取 β－actin作為內(nèi)參照，IL －8、CD14 和 TLR4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量采用 2－ΔΔCt計(jì)算。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 肝素對(duì)IL－8蛋白水平的影響

脂多糖刺激后IL－8蛋白表達(dá)明顯增加，隨著時(shí)間的延續(xù)逐漸上調(diào)，12 h達(dá)到高峰，肝素減少IL－8蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Effect of unfractionated heparin(UFH)on the expression of IL－8 protein induced by LPS in HPMECs.±s.n=3.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs LPS group.圖1 肝素對(duì)LPS刺激的HPMECs IL－8蛋白水平的影響

2 肝素對(duì)IL－8 mRNA水平的影響

脂多糖刺激后2 h IL－8 mRNA表達(dá)增高，隨著時(shí)間的延續(xù)逐漸上調(diào)，在6 h達(dá)到高峰，肝素減少IL－8 mRNA的表達(dá)，見(jiàn)圖2。F

igure 2.Effect of UFH on the expression of IL－8 mRNA induced by LPS in HPMECs.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs LPS group.圖2 肝素對(duì)LPS刺激的HPMECs IL－8 mRNA水平的影響

3 肝素對(duì)TLR4 mRNA水平的影響

脂多糖刺激后2 h TLR4 mRNA表達(dá)增高，隨著時(shí)間的延續(xù)逐漸上調(diào)，在6 h達(dá)到高峰，肝素減少TLR4 mRNA的表達(dá)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Effect of UFH on the expression of TLR－4 mRNA induced by LPS in HPMECs.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs LPS group.圖3 肝素對(duì)LPS刺激的HPMECs TLR4 mRNA水平的影響

4 肝素對(duì)CD14 mRNA水平的影響

脂多糖刺激后沒(méi)有檢測(cè)到CD14 mRNA的表達(dá)。

討 論

TLR4是目前最為廣泛研究的TLR家族成員之一，迄今為止在人類共鑒定出了11種TLR(TLR1～TLR11)，不同的TLR識(shí)別不同的配體，TLR4識(shí)別革蘭氏陰性菌的 LPS［7］。CD14是錨定在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和多形核白細(xì)胞細(xì)胞膜表面的一種糖蛋白，分子量55 kD，其主要作為革蘭氏陰性菌的LPS高親和受體，介導(dǎo)細(xì)胞識(shí)別并捕獲LPS，同時(shí)將信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活細(xì)胞應(yīng)答，在機(jī)體免疫、防御系統(tǒng)引起的一系列病理反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［8］。CD14以2種方式存在，膜型CD14(membrane－bound CD14，mCD14)和可溶型CD14(soluble CD14，sCD14)，其中sCD14主要存在于血清和尿液中［9］。通常認(rèn)為mCD14主要表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等骨髓細(xì)胞，非骨髓細(xì)胞則通過(guò)上清液中sCD14與LPS結(jié)合［10］。根據(jù)目前的研究，LPS可通過(guò)2條途徑激活損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞:一條途徑是LPS與血清中的LBP和sCD14結(jié)合，再通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞上TLR4－MD－2復(fù)合物將LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，直接激活內(nèi)皮細(xì)胞;另一條途徑是LPS先激活單核細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞，使其釋放TNF－α、IL－1β等細(xì)胞因子，間接激活血管內(nèi)皮細(xì)胞［11］。本研究中，應(yīng)用胎牛血清培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，其中含有sCD14，加入LPS刺激后，內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生TLR4增加，并促進(jìn)IL－8的表達(dá)，說(shuō)明LPS通過(guò)TLR4信號(hào)途徑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，與前期研究結(jié)果相一致。

肝素是一種天然形成的氨基葡聚糖，作為一種有效的抗凝劑在臨床應(yīng)用已超過(guò)半個(gè)世紀(jì)的時(shí)間。肝素的抗凝作用得到大家的公認(rèn)，近年來(lái)，一系列臨床和基礎(chǔ)研究表明肝素還可以通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。肝素抑制促炎因子的釋放，包括 IL －1β、IL －6和 TNF － α［12］。肝素抑制缺血再灌注損傷中NF－κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并通過(guò)增加一氧化氮和前列環(huán)素的生成減少了內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙［13］。在高動(dòng)力性膿毒癥中，肝素改善內(nèi)皮細(xì)胞功能和血管反應(yīng)性［14］。肝素減少了內(nèi)毒素鼠TNF－α和IL－1β的表達(dá)，降低中性粒細(xì)胞集聚，減少肝血管中微血栓形成和纖維蛋白(原)沉積，并降低死亡率［15］。本研究中肝素減少了LPS刺激下內(nèi)皮細(xì)胞IL－8的mRNA及蛋白表達(dá)，同時(shí)減少了TLR4 mRNA的表達(dá)，提示肝素可能通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)途徑發(fā)揮在膿毒癥中的抗炎作用。

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