自生固氮菌的篩選及其在滅菌土壤中的生長(zhǎng)特性

黃慧岳，謝達(dá)平

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

氮是農(nóng)作物生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)元素[1]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，氮被視為衡量土壤養(yǎng)分狀況乃至土壤肥力的一個(gè)重要指標(biāo)[2]。作物每年都要從土壤中帶走大量的氮素，為補(bǔ)充土壤氮素的損失，工業(yè)化學(xué)氮肥至今仍然是人類(lèi)向土壤補(bǔ)給氮素的重要來(lái)源。而工業(yè)氮肥的使用造成了土壤酸化和環(huán)境污染等一系列問(wèn)題，阻礙了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3-5]。利用固氮微生物和聯(lián)合固氮微生物等生物固氮來(lái)提高土壤無(wú)機(jī)氮含量是土壤氮肥補(bǔ)充的有效途徑[6]。利用固氮微生物提高農(nóng)作物產(chǎn)量的研究國(guó)內(nèi)報(bào)道較多，其中有選用內(nèi)生固氮菌的，也有選用自生固氮或聯(lián)合固氮微生物的。筆者擬從土壤分離出的自生固氮菌為試驗(yàn)材料，測(cè)定其固氮能力和對(duì)水稻苗生長(zhǎng)的影響，并選擇固氮力較強(qiáng)的菌株，施用于土壤，檢測(cè)其在土壤中的變化趨勢(shì)和對(duì)土壤氮含量的影響，以期尋找到有應(yīng)用價(jià)值的固氮微生物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 試驗(yàn)菌株為自生固氮菌，分離出該菌株的4份土壤來(lái)自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，采集地點(diǎn)分別為藝苑、實(shí)驗(yàn)基地、二食碗池周邊、八教垃圾收集處周邊。

1.1.2 培養(yǎng)基 Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基：甘露醇1%，KH2PO40.02%，MgSO4·7H2O 0.02%，NaCl 0.02%，CaSO4·2H2O 0.01%，CaCO30.5%。固體培養(yǎng)基另加瓊脂8%。

1.1.3 儀 器 恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、試管、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、恒溫培養(yǎng)箱、三角瓶、量筒、蒸汽電熱滅菌鍋、吸管、電子天平、pH計(jì)、紫外分光光度計(jì)、涂布棒、酒精燈、移液槍、凱氏定氮儀等。

1.2 方法

1.2.1 自生固氮菌的初篩及形態(tài)觀察 從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)4個(gè)不同區(qū)域采取土壤樣品，制備土壤菌懸液并取上清液在試管中作梯度稀釋。選取菌懸液0.1 mL涂布于Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)4 d，統(tǒng)計(jì)固氮菌的菌落數(shù)量。選取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，用接種環(huán)挑取不同種類(lèi)的單菌落，接種到新鮮的無(wú)氮培養(yǎng)基上，連續(xù)劃線(xiàn)純化3次，篩選的優(yōu)勢(shì)菌株用30%甘油-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用接種環(huán)挑取菌落，制備鏡檢標(biāo)本，革蘭氏染色，觀察其菌體形態(tài)特征[7-9]。

1.2.2 高效固氮菌株的篩選及對(duì)水稻苗生長(zhǎng)的影響 （1）菌株固氮能力測(cè)定：菌株在無(wú)氮培養(yǎng)基中連續(xù)3次分離純化后，選取長(zhǎng)勢(shì)良好的優(yōu)勢(shì)菌，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，菌液含菌量為2×106cfu/mL，每個(gè)菌株重復(fù)培養(yǎng)3瓶。以10%接種量于250 mL搖瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液總體積50 mL，30℃培養(yǎng)7 d后，用比濁法（OD600值法）評(píng)估細(xì)菌數(shù)量，用微量凱氏定氮法測(cè)定最終菌液的含氮量，篩選固氮能力較強(qiáng)的菌株[10]。（2）菌株對(duì)水稻苗生長(zhǎng)的影響。將篩選得到的4株固氮菌株（A1、A2、A3、A4），分別接種到 100 mL 無(wú)氮液體培養(yǎng)基中，28℃搖瓶培養(yǎng)5 d后血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用去離子水稀釋?zhuān)@得106cfu/mL的菌懸液。將洗凈滅菌的石英砂（粒徑為2.0 mm）等量分裝到直徑12 cm的培養(yǎng)皿中，分別加入以上4種稀釋到同濃度的固氮菌液20 mL，設(shè)置1個(gè)無(wú)菌對(duì)照，每個(gè)培養(yǎng)皿移種催芽露白的水稻種子20粒。處理和對(duì)照均重復(fù)3次。培養(yǎng)10 d后測(cè)量水稻苗的高度，用spss 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 自生固氮菌對(duì)土壤的影響 用固氮能力較強(qiáng)、對(duì)水稻生長(zhǎng)起促進(jìn)作用的菌株接種于土壤，對(duì)土壤中氮細(xì)菌數(shù)量及土壤含氮量進(jìn)行測(cè)定。取篩選的自生固氮菌接種于100 mL無(wú)氮液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)4 d，對(duì)細(xì)菌計(jì)數(shù)并稀釋菌液使其活細(xì)菌濃度為2×106cfu/mL。取稀釋后的菌液100 mL均勻加入到已滅菌的1 kg土壤樣品中，另外取1 kg已滅菌土壤樣品作為對(duì)照樣品。將樣品置于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)自然環(huán)境下40 d，每隔5 d補(bǔ)充噴灑適量蒸餾水，保持土壤濕度恒定。

（1）土壤中氮細(xì)菌數(shù)量的變化：在施用菌液后0、5、10、20、30、40 d，利用最大或然計(jì)數(shù)法（MPN）[11]對(duì)土壤中的細(xì)菌含量進(jìn)行跟蹤測(cè)定。稱(chēng)取1 g土壤樣品，用無(wú)菌水稀釋?zhuān)诿撋珦u床震蕩30 min，搖勻，取稀釋度10-1～10-7，分別進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。取滅菌氮細(xì)菌固體培養(yǎng)基，并用不同稀釋度稀釋菌液各0.1 mL進(jìn)行Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基平板涂布，30℃培養(yǎng)5 d后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。從最大或然數(shù)表中查出最大或然數(shù)近似值，按下列公式計(jì)算樣品中的微生物數(shù)量：

土壤固氮菌數(shù)量（cfu/g）=MD/W

式中M為最大或然數(shù)近似值；D為全部出現(xiàn)菌落的最高稀釋倍數(shù)；W為土壤質(zhì)量（g）。

（2）土壤中總氮含量的測(cè)定：凱氏定氮儀檢測(cè)法[12]測(cè)定土壤中總氮含量，分析施用固氮菌后對(duì)土壤中氮含量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 自生固氮菌的初篩及形態(tài)觀察

利用無(wú)氮培養(yǎng)基平板，從供試的4種土壤中分離出了具潛在固氮能力、菌落形態(tài)不同的菌株23個(gè)。通過(guò)純化培養(yǎng)、革蘭氏染色觀察后，從4個(gè)土壤樣品分離的菌株各挑取1個(gè)典型菌株進(jìn)行研究，分別命名為 A1、A2、A3、A4。如表 1 所示，A1、A2 和A4菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，有芽孢產(chǎn)生，其菌落呈圓形，表面較干燥。A3為革蘭氏陰性菌，無(wú)芽孢產(chǎn)生，菌落形態(tài)不規(guī)則。

表1 固氮細(xì)菌的菌體形態(tài)和菌落特征

2.2 高效固氮菌株的篩選及對(duì)水稻苗的影響

2.2.1 固氮能力檢測(cè) 4株固氮菌搖瓶培養(yǎng)后，其生長(zhǎng)數(shù)量、菌體和介質(zhì)的總氮含量見(jiàn)表2。由于 試驗(yàn)采用的是無(wú)氮培養(yǎng)基，因此氮含量可用于評(píng)估菌株的自生固氮能力。如表2所示，菌株A1、A2、A3、A4都有一定的固氮能力?？傮w來(lái)看，A1、A2的數(shù)量較大，其固氮能力也較強(qiáng)；而A3的數(shù)量一般，固氮能力最弱；A4生長(zhǎng)最緩慢，其固氮能力一般。

表2 菌株固氮能力檢測(cè)

2.2.2 對(duì)水稻苗生長(zhǎng)的影響 固氮菌接種發(fā)芽水稻10 d后檢測(cè)生長(zhǎng)相關(guān)的指標(biāo)，結(jié)果如表3所示，A1對(duì)水稻的促進(jìn)作用一般；A2和A3對(duì)水稻苗生長(zhǎng)促進(jìn)作用較為明顯，與對(duì)照有顯著性差異；A4與水稻苗共培養(yǎng)后，水稻長(zhǎng)勢(shì)不好，甚至對(duì)水稻產(chǎn)生致病癥狀。研究結(jié)果表明，菌株A2的固氮作用較強(qiáng)、增殖能力較好，對(duì)水稻有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)作用。因此，選用菌株A2進(jìn)行土壤中的生長(zhǎng)特性研究。

表3 4株不同固氮菌對(duì)水稻生長(zhǎng)的影響

2.3 固氮菌在滅菌土壤中的生長(zhǎng)特性

2.3.1 滅菌土壤中氮細(xì)菌數(shù)量的變化 對(duì)接種A2固氮菌的土壤用MPN法測(cè)定菌數(shù)，通過(guò)查詢(xún)最大或然數(shù)表計(jì)算得出土壤總固氮菌數(shù)。接種培養(yǎng)0、5、10、20、30、40 d 后，土壤中固氮菌含量分別為1.9×105、4.0×105、5.0×106、2.2×107、9×106、5×106cfu/g。土壤固氮菌數(shù)量變化趨勢(shì)如圖1所示，固氮菌含量在第20天達(dá)到峰值，為2.2×107cfu/g，曲線(xiàn)呈現(xiàn)指數(shù)型增長(zhǎng)，直至第30天細(xì)菌開(kāi)始衰亡。

圖1 滅菌土壤固氮菌數(shù)量變化趨勢(shì)

2.3.2 滅菌土壤中總氮含量的變化 接種菌株A2培養(yǎng) 0、5、10、20、30、40 d 后，土壤氮含量分別為0.007%、0.014%、0.063%、0.280%、0.245%、0.252%。如圖2所示，從施用固氮菌開(kāi)始，前20 d土壤中氮含量隨著固氮菌數(shù)量的增加而持續(xù)增加，與菌體數(shù)量基本呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，且于培育的第20天土壤中總氮含量達(dá)到峰值0.280%。根據(jù)全國(guó)第二次土壤普查土壤養(yǎng)分分級(jí)表，該值已達(dá)到一級(jí)土壤全氮含量標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)（數(shù)據(jù)）以上。30 d后土壤全氮含量并不與微生物數(shù)量呈對(duì)應(yīng)相關(guān)關(guān)系，隨著固氮菌開(kāi)始出現(xiàn)衰亡，前階段所固定氮素并沒(méi)有隨著細(xì)菌的死亡而消失，而是持續(xù)保留于土壤中。

圖2 滅菌土壤氮含量變化趨勢(shì)

3 小結(jié)

滅菌土壤中施用自生固氮菌后，培養(yǎng)約20 d固氮菌數(shù)量達(dá)到最大，為2.2×107cfu/g，固氮菌數(shù)量增加約100倍。土壤中全氮含量高于國(guó)家土壤養(yǎng)分分級(jí)表全氮含量的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。自生固氮菌作為活性微生物，在不同環(huán)境下其生物學(xué)特征、固氮能力、增殖能力等都有可能發(fā)生變化[13]，這將有待于進(jìn)一步的研究。

[1]張世清，李慶洋，高建明，等.24株劍麻根際聯(lián)合固氮菌的16S rDNA 序列分析[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23（11）：132-134.

[2]Ye J Q，Yuan R X，Yu H Y，et al.Dynamic changes of nitrogen in salinealkaline paddy field and its potential environmental impacts[J].Agricultural Science&Technology，2011，12（3）:443-450，460.

[3]IFA.Sustainable Management of the Nitrogen Cyclein Agriculture and Mitigation of Reaetive Nitrogen Side Effects.Firsted[M].Paris：International Fertilizer Industry Assoeiation，2007.

[4]席寅峰，張孟婧，黃小帥，等.1株光合細(xì)菌的分離鑒定及其脫氮能力研究 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38 （27）：14847-14849，14875.

[5]Xu F X，Xiong H，Zhang L，et al.Variation of nitrogen uptake and utilization efficiency of mid-season hybrid rice at different ecological sites under different nitrogen application levels[J].Agricultural Science&Technology，2011，12（7）:1001-1009，1012.

[6]Jaeoud C，Job D，Wadoux P ，et al.Initiation of root growth stimulation by Azospzillum lipoferum CRTI during maize seed germination[J].Mierobiology，1999，45:339-342.

[7]沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:高等教育出版社，2000.

[8]郭立忠，畢建水，祝王業(yè)，等.微生物菌肥中三類(lèi)菌株的分離、純化與部分性質(zhì)鑒定[J].萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，（4）：248-250.

[9]東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[10]鮑士旦.土壤農(nóng)化分析[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[11]楊從發(fā)，王淑軍，陳 靜，等.自生固氮菌的分離鑒定[J].淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，8（3）：56-58.

[12]胡江春，薛德林，馬成新，等.植物根際促生菌（PGPR）的研究與應(yīng)用全景[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，15（10）：1963-1966.

[13]張崇邦，金則心，施時(shí)迪.浙江天臺(tái)山幾種林型下土壤細(xì)菌生理群生態(tài)分布的特性[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，26（3）：269-274.