圓葉無心菜的組織培養(yǎng)技術(shù)研究

方其仙，祖艷群，李 元

（1.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650031；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201）

圓葉無心菜（Arenaria rotumdifolia Bieberstein）為石竹科（Caryophyllaceae）石竹目植物，分布較廣，在海拔2 300～3 600 m的地區(qū)，如云南會澤、大理、洱源、鎮(zhèn)康、麗江、維西、德欽等地都有生長。圓葉無心菜莖側(cè)被短柔毛，其葉圓形或卵圓形；花瓣短于萼片，一年生或多年生野生植物，葉對生，花白色，排成頂生的聚傘花序；萼片5；花瓣5；常全緣，很少缺；蒴果卵球形或長圓形。

在云南會澤鉛鋅礦區(qū)，圓葉無心菜能頑強生長，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)是Pb的一種超累積植物。但至還未見今國內(nèi)外報道圓葉無心菜的人工繁育和栽培技術(shù)，且很難采到其種子。因此，通過組織培養(yǎng)技術(shù)，對圓葉無心菜的無性系進行研究，以期解決礦區(qū)植物所需大量種苗供應(yīng)問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以野生植物圓葉無心菜的頂芽和嫩莖為外植體?；九囵B(yǎng)基選用MS，根據(jù)培養(yǎng)要求，添加不同濃度的細胞分裂素（6-BA）、生長素（NAA）。培養(yǎng)基pH值為5.8，蔗糖3%，瓊脂為7 g/L，誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基用MS，蔗糖2%，微量元素適當(dāng)降低。培養(yǎng)基在高壓滅菌鍋中 0.1×1012～0.101×1012Pa 氣壓下保持20 min滅菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 愈傷誘導(dǎo) 將小苗在自來水下沖洗10～20 min后，在接種室用70%的酒精浸泡消毒30 s，用10%NaClO消毒8～10 min，再用無菌水反復(fù)沖洗3次，在無菌條件下切取0.4～0.6 cm的頂芽和嫩莖，接種到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照強度 1 600～2 400 lx，光照時間 12 d。培養(yǎng)30 d后，觀察其愈傷組織的形成情況。

1.2.2 不定芽分化 將形成的愈傷組織接種到添加不同濃度的6-BA、NAA的MS培養(yǎng)基上，進行芽分化培養(yǎng)，30 d后觀察統(tǒng)計不定苗長出的葉片數(shù)量、莖高、莖粗，觀察其長勢。

1.2.3 不定芽生根 將分化培養(yǎng)基中生長良好的不定苗，接種到MS或1/2 MS附加不同濃度6-BA、NAA的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d時統(tǒng)計。

1.2.4 煉苗與移栽 試驗在組培苗出瓶前2 d把瓶蓋打開，其中20%完全去掉瓶蓋，其余保持瓶蓋半遮瓶口，2 d后將組培苗從瓶口取出，用清水洗凈根部所沾的培養(yǎng)基，再用1‰KMnO4溶液浸泡30 s（防止根系腐爛），濾干后移栽到經(jīng)高溫滅菌的基質(zhì)（珍珠巖∶沙土=1∶2）中，然后置于溫室中 15 d，統(tǒng)計移栽成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 圓葉無心菜愈傷組織的誘導(dǎo)

由表1可見，不同濃度的生長素對圓葉無心菜愈傷組織的誘導(dǎo)具有不同的影響。添加0.2 mg/L 6-BA、0.02 mg/L NAA時，愈傷組織形成率達85%。該培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織顏色嫩綠，外形光滑、較軟，呈顆粒狀，這樣的愈傷組織具有分化能力。這表明MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.02 mg/L是誘導(dǎo)圓葉無心菜形成具有分化能力的愈傷組織較理想的培養(yǎng)基配方。

表1 不同濃度的生長素對圓葉無心菜愈傷組織的誘導(dǎo)影響

2.2 不同濃度激素對愈傷組織分化的影響

從表2中可以看出，這幾種培養(yǎng)基都可以誘導(dǎo)分化出不定芽，但分化率不一樣，在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上，整個愈傷組織塊上都布滿了分化芽，平均每塊愈傷組織可分化出9.90個不定芽，而且分化苗的長勢也較好。因此，該培養(yǎng)基是誘導(dǎo)圓葉無心菜愈傷組織芽分化的理想培養(yǎng)基。

表2 不同濃度生長素對不定芽分化的影響

2.3 不同濃度激素對分化芽生長的影響

雖然愈傷組織在這幾種培養(yǎng)基中都能誘導(dǎo)出分化芽，且數(shù)量也較多，但分化芽的長勢不一樣，30 d時觀察結(jié)果見表3。由表3可見，幾種培養(yǎng)基中，不定芽在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中長勢最好。因此，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L是圓葉無心菜不定芽生長的理想培養(yǎng)基。

表3 不同濃度激素對分化芽生長的影響

2.4 不同濃度生長素對組培苗不定根生長的影響

由表4可見，組培苗在MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中生根率達11.70/株，接種一個星期后即可形成可見根，并且根系生長速度快，長勢好。

表4 不同濃度生長素對組培苗不定根生長的影響

2.5 煉苗及移栽

20%小苗完全去掉瓶蓋，1 d內(nèi)即萎蔫，其余小苗煉苗2 d后經(jīng)清潔處理，栽到經(jīng)高溫滅菌的基質(zhì)，溫室中栽培15 d，成活率也很低，只有10%。

3 討論

3.1 外植體的消毒

試驗得知，最適合圓葉無心菜的消毒方法是：自來水沖洗干凈，70%酒精浸泡30 s，10%NaClO消毒8～10 min，再用無菌水沖洗3次，如果浸泡時間不夠，內(nèi)部病毒難以滅凈，會在1～2個星期以后出現(xiàn)污染，如果浸泡時間過長，則會引起外植體失綠而死亡。

3.2 污染苗的消毒再利用

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，長出叢生芽后，培養(yǎng)基出現(xiàn)污染跡象，并逐漸向上蔓延；還有一種現(xiàn)象：一瓶內(nèi)多個外植體，只一個污染。暫把這些情況下培養(yǎng)瓶內(nèi)還未被污染的外植體或小苗統(tǒng)稱為準污染苗。試驗表明：不經(jīng)消毒，直接在無菌條件下轉(zhuǎn)接準污染苗仍繼續(xù)污染；若把準污染苗用酒精浸泡15 s，然后用無菌水沖洗干凈，再轉(zhuǎn)接可以正常生長。

3.3 煉苗及移栽

組培苗出瓶后，為適應(yīng)外部環(huán)境，有一個煉苗的過渡階段。從煉苗到移栽這一階段，成活率很低，其原因可能是：①叢生芽轉(zhuǎn)接直接誘導(dǎo)生根，小苗太弱，出瓶后適應(yīng)力差；②有的組培苗根部移栽時帶有愈傷組織，影響小苗生長；③出瓶操作不細致，若在生根液中浸泡1 min，再移栽，可提高成活率；④置于溫室后可能溫濕度控制不夠、波動過大、管理不善所致。

4 小結(jié)

（1）以頂芽和帶節(jié)的嫩莖為外植體，在MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.02 mg/L能較好的誘導(dǎo)出愈傷組織。

（2）培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L芽的分化有較好的效果，平均每塊愈傷組織可分化出9.90個不定芽，且分化苗的長勢也較好。

（3）在培養(yǎng)基MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L中生根效果較好，生根率達11.7/株，接種一個星期后即可形成可見根，并且根系生長速度快，長勢好。

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