BraSDG8 RNA干擾載體的構(gòu)建及其對擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

姜 玲，謝青軒，虢婷婷，阮 穎

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

組蛋白甲基化作為一個重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記[1]，對植物開花起調(diào)控作用[2]。擬南芥SDG8（SET DOMAIN GROUP 8）編碼的是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶[3]，約含有1 806個氨基酸序列，能特異催化組蛋白H3K36的雙、三甲基化，是FLC表達(dá)所需的表觀遺傳記憶密碼之一，在抑制植物早花過程中起重要作用[4]。功能缺失的擬南芥sdg8突變體[5-6]36的雙、三甲基化水平顯著降低，開花調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子FLC的轉(zhuǎn)錄激活受到抑制[7]，進(jìn)而植株表現(xiàn)為早花表型[8]。

BraSDG8是湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控研究室在白菜型油菜中克隆的擬南芥SDG8的同源基因，cDNA全長4 963 bp，編碼1 654個氨基酸，結(jié)構(gòu)域的組成與擬南芥SDG8完全一致，包含 AWS（associated with SET）domain、SET domain和Post SET domain 3個結(jié)構(gòu)域，同屬于ASH1家族，推測BraSDG8與SDG8具有相似的生物學(xué)功能[9]。筆者通過構(gòu)建pFGC5941-BraSDG8 RNA干擾載體及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化，旨在為進(jìn)一步研究白菜型油菜BraSDGG8的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）哥倫比亞生態(tài)型Col，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，農(nóng)桿菌（A－grobacterium tumefaciens）GV3101 和 pFGC5941 表達(dá)載體由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控實驗室保存；pMD-19 T Vector購自TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 BraSDG8-1片段的擴增 比對擬南芥SDG8和BraSDG8 cDNA序列，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計引物，分別在5′端導(dǎo)入2個酶切位點（AscⅠ/BamHⅠ），預(yù)計擴增產(chǎn)物大小為443 bp，引物序列如下。

BraSDG8-1 F：5′-GGCGCGCCGGATCCCCAAG CATCAAGTGGCTCT-3′（NcoⅠ/XbaⅠ）

BraSDG8-1 R：5′-CCATGGTCTAGAGCACAGA GTTGATAACTTCTGAATCTGGT-3′

PCR擴增（Tm=57℃），回收片段，連接至pMD19-T載體構(gòu)建成pMD19-T-BraSDG8-1，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將陽性菌落經(jīng)PCR驗證后送博尚生物公司測序，所得結(jié)果在The Brassica database（BRAD）上進(jìn)行序列比對分析。

1.2.2 BraSDG8 RNA干擾載體的構(gòu)建 如圖1所示，BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切載體pMD19-TBraSDG8-1和pFGC5941，將目的片段反向插入至查爾酮內(nèi)含子與Ocs終止子之間，構(gòu)建表達(dá)載體p-BraSDG8-1；然后AscⅠ和NcoⅠ雙酶切載體pMD19-T-BraSDG8-1和p-BraSDG8-1，將目的片段正向插入至35 S啟動子與查爾酮內(nèi)含子之間，構(gòu)建BraSDG8 RNA干擾載體，記為p-BraSDG8。

將構(gòu)建好的RNA干擾載體分別導(dǎo)入大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌GV3101中，測序驗證。

1.2.3 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 采用浸花法將p-BraSDG8載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col生態(tài)型。通過卡那霉素（濃度為40 mg/L）篩選獲得抗性苗，改良的CTAB法提取葉片總DNA，PCR檢測。引物序列如下。

35s825F：5′-ATCCCACTATCCTTCGCAAGACC CTT-3′

Intron825R：5′-TGACTCCATCTTATTCCCTCCG TTTC-3′

2 結(jié)果與分析

2.1 BraSDG8-1干擾片段的克隆與檢測

克隆得到440 bp左右的目的片段，將目的片段連接至pMD19-T載體上，通過熱激法轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α中，獲得陽性菌落，PCR檢測片段為440 bp左右，符合預(yù)期片段大?。▓D2）。

將目的片段測序，測序結(jié)果與RNA干擾片段進(jìn)行序列比對，同源性達(dá)100%，MegAlign比對（圖3），BraSDG8-1基因片段序列完整正確，可用于后

2.2 干擾載體的酶切驗證

用BamHⅠ和XbaⅠ分別單酶切p-BraSDG8驗證（圖4），最終分別得到了1 300 bp和2 500 bp左右的條帶，符合預(yù)期片段大小，表明BraSDG8 RNA干擾載體p-BraSDG8構(gòu)建成功。

2.3 轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌的質(zhì)粒PCR檢測

通過凍融法將干擾載體轉(zhuǎn)至根癌農(nóng)桿菌GV3101，提取陽性菌落質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR檢測，擴增得到的條帶大小為400 bp左右（圖5），與設(shè)計的目的片段大小443 bp相符，說明干擾載體已轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌中。

2.4 抗性苗的PCR檢測

通過改良的CTAB法提取抗性苗總DNA，擴增結(jié)果如圖6，檢測得到1株陽性植株。片段大小與預(yù)期片段大小一致，為1 200 bp左右。

2.5 BraSDG8沉默的轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察

在含有卡那霉素（濃度為40 mg/L）的MS培養(yǎng)基上，抗性苗生長健壯，子葉飽滿而呈綠色，根系發(fā)育正常，而非抗性苗子葉呈黃色，個體較小，根長相對短?。▓D7）。與野生型擬南芥Col生態(tài)型相比，在營養(yǎng)生長期，轉(zhuǎn)基因植株的蓮座葉數(shù)目以及生長狀態(tài)都沒有明顯區(qū)別；在生殖生長期，轉(zhuǎn)基因植株的花期并未縮短，只是花苔數(shù)目和果莢數(shù)目變少，每個果莢的結(jié)實率降低。

3 討 論

組蛋白甲基化作為一個重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記[10-11]，是植物發(fā)育過程中的重要調(diào)節(jié)方式，其主要是由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histone methyltransferases，HMTs）來調(diào)控的[12-13]。其中，組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（histone lysine methyltransferase，HLMT）是一類含有 SET（Su（var），Enhancer of zeste，Trithorax）結(jié)構(gòu)域的家族[14]。進(jìn)化上保守的SET結(jié)構(gòu)域包含約130個氨基酸序列，形成一個結(jié)狀結(jié)構(gòu)的酶催化中心[15]，通過催化組蛋白甲基化來影響染色體的結(jié)構(gòu)進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)[16]。早前的研究顯示，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了約47個SET DOMAIN GROUP（SDG）基因[17]，分別命名為 SDG1～SDG47，其中 SDG8，SDG25，SDG27和SDG30編碼的SET結(jié)構(gòu)域蛋白涉及植物開花時間的調(diào)控[18]。RNAi是研究基因功能的重要方法[19-20]。BraSDG8是擬南芥SDG8的同源基因，二者的相似性非常高，筆者通過構(gòu)建干擾載體轉(zhuǎn)化擬南芥，在克隆得到BraSDG8全長cDNA序列的基礎(chǔ)上，選取其中一段保守片段構(gòu)建RNA干擾載體pFGC5941-BraSDG8，并通過農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)，浸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col，獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。但是與野生型擬南芥（Col）相比，該轉(zhuǎn)基因植株開花時間、植株大小、蓮座葉數(shù)目等表型并未有明顯差異，其具體的原因有待進(jìn)一步研究。

[1]杜婷婷，黃秋花.組蛋白賴氨酸甲基化在表觀遺傳調(diào)控中的作用[J].遺傳，2007，29（4）：387-392.

[2]夏志強，何奕昆，鮑時來，等.植物開花的組蛋白甲基化調(diào)控分子機理[J].植物學(xué)通報，2007，24（3）：275-283.

[3]謝 萍，田春艷，張令強，等.組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的研究進(jìn)展[J].遺傳，2007，29（9）：1035-1041.

[4]Zhao Z,Yu Y,Meyer D,et al.Prevention of early?owering by expression of FLOWERING LOCUS C requires methylation of histone H3K36[J].Nat.Cell Biol,2005,（7）:1256-1260.

[5]孫萬剛.擬南芥突變體構(gòu)建方法及目的基因分離鑒定技術(shù)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（18）：9433-9434.

[6]Xu P L,Zhan J P,Meng J J,et al.A rapid DNA extraction method for PCR detection of Arabidopsis thaliana[J].Agricultural Science&Technology，2010，11（3）：41-42，155.

[7]李紅梅，任 艷，魏艷麗，等.擬南芥開花時間的分子遺傳調(diào)控[J].山東科學(xué)，2007，20（1）：48-53.

[8]Xu L,Zhao Z,DongA,et al.Di-and Tri-but Not Monomethylation on Histone H3 Lysine 36 Marks Active Transcription of Genes Involved in Flowering Time Regulation and Other Processes in Arabidopsis thaliana[J].Mol.Cell.Biol,2008,20（4）:1348-1360.

[9]謝青軒，彭 琦，劉春林，等.白菜型油菜BraSDG8基因的克隆與序列分析 [J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，37（4）：372-375.

[10]李 想，張飛雄.組蛋白甲基化的研究進(jìn)展[J].遺傳，2004，26（2）：244-248.

[11]田筱青，房靜遠(yuǎn).組蛋白甲基化研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2006，33（6）：511-516.

[12]He Y H.Control of the transition to flowering by chromatin modifications[J].Mol.Plant,2009,2（4）:554-564.

[13]Martin C,Zhang Y.The diverse functions of histone lysine methylation[J].Nat.Rev,2000,6（11）:838-849.

[14]Ng D W,Wang T,Chandrasekharan M B,et al.Plant SET domain-containing proteins:structure,function and regulation[J].Biochim.Biophys.Acta,2007,1769:316-329.

[15]Qian C,Zhou M M.SET domain protein lysine methyltransferases:Structure,specificity and catalysis[J].Cell Mol.Life Sci,2006,63（23）:2755-2763.

[16]Sims RJ III,Nishioka K,Reinberg D.Histone lysine methylation:a signature for chromatin function [J].Trends Genet,2003,19:629-639.

[17]宋江華，曹家樹.植物SET蛋白 [J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2007，（29）：384-388.

[18]Baumbusch L O,Thorstensen T,Krauss V,et al.The Arabidopsis thaliana genome contains at least 29 active genes encoding SET domain proteins that can be assigned to four evolutionarily conserved classes[J].Nucl.Acids Res,2001,29:4319-4333.

[19]李蘭嵐，饒力群，范 適，等.RNAi技術(shù)及其在植物中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2005，11（4）：313-318.

[20]左 剛，毛建平.轉(zhuǎn)錄水平siRNA介導(dǎo)的基因沉默[J].中國生物工程雜志，2005，25（12）：78-81.