高效液相色譜法測定不同方法提取非洲馬鈴果中的柳葉水甘草堿

王 榮， 李多偉

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710069)

非洲馬鈴果Voacanga africana Stapf又名非洲伏康樹、非洲沃坎加樹，是一種產(chǎn)自非洲的夾竹桃科植物。這種植物在新幾內(nèi)亞、印度尼西亞和菲律賓被記錄過，它被描述為在亞洲很普遍，而且是最容易變異的種類。國外研究發(fā)現(xiàn)，非洲馬鈴果的提取物對(duì)體外大鼠臂旁核神經(jīng)元興奮和突觸傳遞具有調(diào)節(jié)作用［1］，其樹皮提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠有抗?jié)冃?yīng)［2］，對(duì)62.5% ～87.5%的小鼠的驚厥及轉(zhuǎn)向行為紊亂有抑制作用［3］。近年來，對(duì)非洲馬鈴果藥用價(jià)值的研究認(rèn)為，非洲馬鈴果提取物可用于治療中風(fēng)后遺癥、缺血性高血壓腦病等，還有提高記憶力，改善視力，抗衰老等作用。因此，近年來非洲馬鈴果的應(yīng)用價(jià)值受到越來越廣泛的關(guān)注。

柳葉水甘草堿 (Tabersonine)又名它波寧，是非洲馬鈴果中的一種單吲哚類生物堿，屬長春花屬生物堿中的白堅(jiān)木堿型。分離純化的柳葉水甘草堿為油狀液體，弱堿(pKa=5.77)，分子式為C21H24N2O2;貓?bào)w試驗(yàn)結(jié)果顯示，柳葉水甘草堿有降血壓的作用，其強(qiáng)度為利血平的25%［4］。柳葉水甘草堿作為重要藥物長春胺的合成前體［5］，具有重要的開發(fā)利用價(jià)值。長春胺可用于治療慢性缺血性腦血管病、腦梗塞、老年癡呆等癥［6-8］，具有活血降壓、改善視力、抗衰老和抗氧化等作用［9-11］。目前，長春胺雖已可人工全合成，但以柳葉水甘草堿為前體半合成長春胺的思路，啟發(fā)了一種長春胺獲得的新途徑。又因柳葉水甘草堿在非洲馬鈴果中的含有量相對(duì)較高，可達(dá)到2%［12］，且市面上對(duì)其需求日益增加，因此可通過從非洲馬鈴果中提取來進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)致力于建立一種準(zhǔn)確、高效、快捷的柳葉水甘草堿測定方法，以期為柳葉水甘草堿的測定提供科學(xué)有效的檢測手段，并對(duì)提取條件做優(yōu)化篩選，為實(shí)際生產(chǎn)提供引導(dǎo)。

1 儀器與試藥

島津LC—20A型高效液相色譜系統(tǒng):包括LC—20AT型高壓恒流泵、SPD—20A檢測器和LC Solution工作站;柳葉水甘草堿對(duì)照品 (美國Sigma公司);非洲馬鈴果 (英杰華納生物工程有限公司);乙腈為色譜純，其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為二次蒸餾水，流動(dòng)相經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜濾過。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Inertsil C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.1 mol/L碳酸銨溶液 (7∶3，v/v);體積流量1.2 mL/min;檢測波長275 nm;柱溫為室溫;進(jìn)樣量20 μL。在該色譜條件下，柳葉水甘草堿的保留時(shí)間約為15 min，色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 色譜條件優(yōu)選 本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了0.7 mL/min，1.0 mL/min和1.2 mL/min 3種體積流量下柳葉水甘草堿的分離效果，結(jié)果表明體積流量對(duì)柳葉水甘草堿的峰形影響不大，只對(duì)保留時(shí)間有較大的影響。在0.7 mL/min體積流量下樣品中柳葉水甘草堿出峰時(shí)間大約在26 min左右，1.0 mL/min體積流量下保留時(shí)間約為18 min，而在1.2 mL/min體積流量下保留時(shí)間約為15 min。本實(shí)驗(yàn)選擇體積流量為1.2 mL/min。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柳葉水甘草堿對(duì)照品0.050 0 g，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液，貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 樣品溶液的制備

2.4.1 冷浸提取 準(zhǔn)確稱取5.00 g非洲馬鈴果粉末12份，分別浸于50 mL 95%甲醇、95%乙醇、正己烷和石油醚中，每種溶劑3份。冷浸24 h，過濾，濾液分別用各自溶劑定容至50 mL，貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 熱回流提取 準(zhǔn)確稱取5.00 g非洲馬鈴果粉末12份，分別浸于50 mL 95%甲醇、95%乙醇、正己烷和石油醚中，每種溶劑3份。熱回流提取1.5 h，過濾，濾液分別用各自溶劑定容至50 mL，貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.3 超聲提取 準(zhǔn)確稱取5.00 g非洲馬鈴果粉末12份，分別浸于50 mL 95%甲醇、95%乙醇、正己烷和石油醚中，每種溶劑3份。超聲法提取30 min，過濾，濾液分別用各自溶劑定容至50 mL，貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 供試品溶液的制備 精密吸取2.4項(xiàng)中各樣品溶液1 mL，蒸干溶劑，分別加甲醇超聲溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.3項(xiàng)中對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL定容至10 mL。按2.1項(xiàng)中色譜條件測定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=15 749X－1 092，r=0.999 5，線性范圍為0.02～0.2 mg/mL。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液20 μL，按2.1項(xiàng)中色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果峰面積積分值的 RSD為0.75%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已測定的樣品溶液2 mL，共5份，分別加入2.3項(xiàng)中的對(duì)照品溶液0.5 mL，按2.5項(xiàng)中方法制備成供試品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后供HPLC檢測，進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

2.9 樣品測定 將2.5項(xiàng)中制備的供試品溶液，按2.1項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

由表2可知，以柳葉水甘草堿含有量為指標(biāo)，冷浸法中各溶劑提取率大小依次為正己烷＞95%甲醇＞95%乙醇＞石油醚;熱回流法為95%甲醇＞95%乙醇＞正己烷＞石油醚;超聲法為95%甲醇＞95%乙醇＞石油醚＞正己烷。

此外，以HPLC色譜圖中雜質(zhì)峰出現(xiàn)的多少為指示，可知95%甲醇和95%乙醇提取的樣液中雜質(zhì)較多，正己烷和石油醚提取的樣液中雜質(zhì)較少。

表1 柳葉水甘草堿加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

表2 不同方法提取柳葉水甘草堿的結(jié)果比較(n=3)

總之，3種方法中以熱回流法提取柳葉水甘草堿含有量最高，分別達(dá)到冷浸法和超聲法的約3.6倍和1.5倍。優(yōu)選溶劑時(shí)，綜合考慮提取量和雜質(zhì)量的雙重因素，確定最佳提取溶劑為正己烷。

3 討論

目前，柳葉水甘草堿的測定方法國內(nèi)報(bào)道甚少，本研究建立了柳葉水甘草堿測定的高效液相色譜法，并對(duì)測定柳葉水甘草堿的色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化篩選，結(jié)果顯示，當(dāng)流動(dòng)相體積流量為1.2 mL/min時(shí)保留時(shí)間最短，約為15 min。

此外，在上述建立的檢測方法下對(duì)不同方法提取的非洲馬鈴果中柳葉水甘草堿進(jìn)行了測定，并對(duì)4種溶劑的提取率進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，冷浸法中以正己烷提取率最高，熱回流法和超聲法中均以95%甲醇提取率最高，但較正己烷和石油醚而言，95%甲醇和95%乙醇提取的樣液中雜質(zhì)較多，考慮到后續(xù)純化工作的需要，選擇正己烷熱回流法提取非洲馬鈴果中的柳葉水甘草堿。因此，綜合考慮，確定最佳提取方案為正己烷熱回流法。

從非洲馬鈴果中提取柳葉水甘草堿最大的好處就是獲得量高。經(jīng)測定，本實(shí)驗(yàn)中確定的正己烷熱回流法提取的柳葉水甘草堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.7%，具備生產(chǎn)的含有量要求，因此可用于實(shí)際生產(chǎn)。

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