復(fù)方魚腥草合劑的HPLC指紋圖譜研究*

李轉(zhuǎn)花，胡思玉，余啟波，張德奎

四川科倫藥物研究有限公司，成都 610500

復(fù)方魚腥草合劑由魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、連翹、金銀花5味藥經(jīng)加工制成的復(fù)方制劑[1]。具有清熱解毒之功效，用于外感風(fēng)熱引起的咽喉疼痛，急性咽炎、扁桃腺炎等。為了控制復(fù)方魚腥草合劑的質(zhì)量，有必要研究復(fù)方魚腥草合劑的質(zhì)量檢測方法。近年來有不少文獻(xiàn)報道采用高效液相色譜法測定復(fù)方魚腥草合劑中的黃芩苷、綠原酸的含量，但未見相關(guān)的指紋圖譜研究報道。本文探索了以HPLC指紋圖譜技術(shù)為手段的質(zhì)量控制方法[2]，以期更有效控制該產(chǎn)品的一致性、重現(xiàn)性。

1 儀器與試藥

色譜儀：Waters2695-2996高效液相色譜儀（包括四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測器、Empower色譜工作站）。

黃芩苷 （110715-200815）、綠原酸 （110753-200413）、槲皮苷（111538-200302）購自中國藥品生物制品檢定所；復(fù)方魚腥草合劑由浙江國境藥業(yè)有限公司提供；甲醇為色譜純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑為分析純；水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（150mm×4.6mm，5μm）；以0.1%磷酸溶液為流動相A，甲醇為流動相B；檢測波長為320 nm；柱溫：35℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；分析時間：66 min。理論板數(shù)按黃芩苷峰計算應(yīng)不低于4500。按表1條件進(jìn)行梯度洗脫。

表1 流動相梯度洗脫條件

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取黃芩苷對照品、綠原酸對照品、槲皮苷對照品適量，分別加甲醇制成混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取復(fù)方魚腥草合劑適量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 藥材溶液 取復(fù)方魚腥草合劑處方中的各藥材，按照處方比例和提取工藝制備成魚腥草供試品溶液、金銀花供試品溶液、黃芩供試品溶液、連翹供試品溶液、板藍(lán)根供試品溶液，分別取適量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為藥材溶液供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 指紋圖譜的方法學(xué)驗(yàn)證條件的優(yōu)化 由于中藥復(fù)方的成分復(fù)雜，優(yōu)化的目的是盡量將不同極性的成分簡化在一張色譜圖中得到較好的分離.試驗(yàn)了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸不同梯度下的色譜圖，比較了Inertsil ODS-3 150 mm×4.6 mm，5 μm和Alltech C18150 mm×4.6 mm，5 μm及Waters C18150 mm×4.6 mm，5 μm等不同牌號的色譜柱的分離效果，并對檢測波長和柱溫等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了“2.1”所述色譜條件。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取復(fù)方魚腥草合劑，按“2.2.2”供試品溶液的制備方法處理，于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣進(jìn)行分析，直觀觀察各指紋圖譜的全貌無明顯差異，用相似度軟件計算，在同臺儀器測定色譜指紋圖譜的相似度均大于0.98。計算各共有色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均低于2%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密量取復(fù)方魚腥草合劑，按“2.2.2”供試品溶液的制備方法處理，連續(xù)進(jìn)樣5次檢測，直觀觀察各指紋圖譜的全貌無明顯差異，用相似度軟件計算，在同臺儀器測定色譜指紋圖譜的相似度均大于0.98。計算各共有色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均低于2%，表明精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取復(fù)方魚腥草合劑，按“2.2.2”供試品溶液的制備方法處理，取供試品溶液6份，分別進(jìn)樣測定，觀察各指紋圖譜無明顯差異，用相似度軟件計算，在同臺儀器測定色譜指紋圖譜的相似度均大于0.98。計算各共有色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均低于2%，表明重復(fù)性良好。

2.3.5 指紋圖譜建立 精密吸取對照品溶液、藥材溶液、供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按選定的色譜條件，進(jìn)行檢測。同一實(shí)驗(yàn)條件下，測定12批供試品HPLC色譜圖。根據(jù)不同批次供試品測定結(jié)果所給出的峰數(shù)、峰值（積分值）和峰位（相對保留時間）等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析、比較，制定優(yōu)化的指紋圖譜，見圖1～4。

2.4 指紋圖譜分析

2.4.1 共有指紋峰的標(biāo)定 分別取各批次復(fù)方魚腥草合劑，按“2.2.2”項(xiàng)方法處理獲得供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，記錄HPLC色譜圖，結(jié)果見圖4。主要有9個峰：2號峰為綠原酸；7號峰為黃芩苷；1號峰、6號峰來自于金銀花；3、8號峰來自于黃芩；4號峰來自于連翹；5號峰為黃芩和連翹共有；9號峰來自于魚腥草。因黃芩苷的吸收最強(qiáng)，故以黃芩苷作為參照峰。

經(jīng)與參照品對照及比較所有測定和記錄的色譜圖，各批次復(fù)方魚腥草合劑標(biāo)定9個共有峰作為指紋圖譜的特征峰（見表2及色譜圖3～4），其中黃芩苷峰為參照峰。

圖1 對照品圖譜

圖2 藥材圖譜

圖3 對照指紋圖譜

圖4 12批樣品指紋圖譜

2.4.2 各批次復(fù)方魚腥草合劑指紋圖譜相似度評價 將各批次樣品測定數(shù)據(jù)導(dǎo)入中國藥典委員會推薦使用的 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件2004A”，經(jīng)選峰，設(shè)定匹配模板，將峰自動匹配，然后設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)模板，進(jìn)行譜峰差異性評價和整體相似性評價。通過中藥指紋圖譜相似度計算軟件得出復(fù)方魚腥草合劑HPLC對照指紋圖譜，與對照指紋圖譜比較，相似度結(jié)果見表3。

3 討 論

3.1 檢測波長的選擇，DAD圖譜可見，本品在200 nm～400 nm之間，9個共有峰均有吸收，最終選擇共有峰吸收最強(qiáng)的320 nm作為測定波長。

3.2 本品中魚腥草雖為君藥，其抗菌活性成分癸酰乙醛含量測定已有文獻(xiàn)報道[3]，但采用的是分光光度法，利用HPLC法測定鮮見報道。黃芩苷是復(fù)方魚腥草合劑的主要藥理活性成分，黃芩中有效成分黃芩苷具有良好的抗炎、抗菌、抗變態(tài)反應(yīng)，且在本色譜系統(tǒng)中吸收最強(qiáng)。故采用黃芩苷作為參照品。

表2 各批次復(fù)方魚腥草合劑指紋圖譜共有峰相對保留時間

表3 復(fù)方魚腥草合劑指紋圖譜相似度數(shù)據(jù)

3.3 在本法條件下復(fù)方魚腥草合劑中9個共有峰分離良好，相似度分析結(jié)果表明，各批次復(fù)方魚腥草合劑之間具有較好的相似性，相似度均大于0.98。本文建立的復(fù)方魚腥草合劑指紋圖譜具有重復(fù)性好、特征性強(qiáng)、方法簡便等特點(diǎn)，為復(fù)方魚腥草合劑的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

3.4 復(fù)方魚腥草合劑處方中的魚腥草、金銀花、連翹中均含有揮發(fā)性成分，本文主要考察了非揮發(fā)性成分的指紋圖譜檢測方法，還需對揮發(fā)性成分進(jìn)行氣相色譜研究，建立檢測揮發(fā)性成分的指紋圖譜，為更全面地控制復(fù)方魚腥草合劑的質(zhì)量提供依據(jù)。3.5 表3相似度計算結(jié)果均大于0.98，說明復(fù)方魚腥草合劑的工藝穩(wěn)定，不同批次產(chǎn)品的一致性較好。

[1] 國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].WS-10821（ZD-0821）-2002-2011Z.

[2] 李曉蒙，徐位良，何新榮.魚腥草藥材中黃酮苷類成分的HPLC指紋圖譜研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2005，21（2）：140.

[3] 張 輝，田 英.魚腥草中癸酰乙醛含量的測定[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2003，20（4）：583-5.