毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定腐胺與亞精胺

陳素艷，錢(qián)勇強(qiáng)，鄭阿萍，王力

（廈門(mén)集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門(mén)361021）

多胺（polyamine，PA）是一類(lèi)含有兩個(gè)或更多氨基的化合物，在生物體內(nèi)廣泛存在，最常見(jiàn)的多胺包括腐胺（Putrescine，Pu）、亞精胺（Spermidine，Spd）和精胺（Spermine，Spm）。多胺是生物體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的具有較高生物活性的、低分子量脂肪族含氮堿，具有刺激生長(zhǎng)，延緩衰老的作用，并與植物的抗逆性關(guān)系密切[1]。適量的多胺有促進(jìn)組織生長(zhǎng)的作用，過(guò)量的多胺不僅能加強(qiáng)組胺的毒性，而且還會(huì)與亞硝酸鹽反應(yīng)生成雜環(huán)類(lèi)致癌亞硝胺，引起外部血管膨脹，導(dǎo)致高血壓和頭痛，以及腸道平滑肌的收縮造成腹部痙攣、腹瀉和嘔吐等[2]。亞精胺廣泛分布在生物體內(nèi)，是由腐胺和腺苷甲硫氨酸生物合成的；腐胺是利用鳥(niǎo)氨酸脫羧而產(chǎn)生的，作為一種腐毒堿存在于腐敗物中，可是也作為生物體的正常成分而廣泛存在著。

目前，分離檢測(cè)腐胺和亞精胺的方法有很多種，比如：高效液相色譜法[3]、離子色譜法[4]、酶聯(lián)免疫法[5]和毛細(xì)管電泳法[6]等。這些方法都有本身的優(yōu)劣性，高效液相色譜法具有方法快速、靈敏、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，但儀器體積大、不便攜、成本高[7]等；毛細(xì)管電泳作為一種高效分離分析技術(shù)，因其進(jìn)樣量小，分離模式多，分析對(duì)象廣等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[8]，聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光作為一種高靈敏、快速的檢測(cè)方法，具有較好的時(shí)空可控性，在高通量分析中具有潛在應(yīng)[9]，毛細(xì)管電泳（CE）分離-三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）32+]電化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)聯(lián)用具有靈敏度高、線性范圍廣、時(shí)空可控性好、分離效率高、分析速度快、造價(jià)低廉、樣品消耗量少及儀器簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[10]；劉慧靜等采用毛細(xì)管電泳（CE）分離-三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）32+]電化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)聯(lián)用技術(shù)分離檢測(cè)了苦參堿和槐定堿[11]；本實(shí)驗(yàn)選取毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光法分離檢測(cè)葡萄酒中的腐胺和亞精胺。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

MPI-A 型毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)（西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司，中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所），包括電化學(xué)分析儀，數(shù)控毛細(xì)管電泳高壓電源，多功能化學(xué)發(fā)光分析儀，多功能化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器；未涂層熔融石英毛細(xì)管（內(nèi)徑25 μm×50 cm）：河北永年銳灃色譜器件有限公司；pH211C 型酸度計(jì)：北京哈納科儀科技有限公司；Milli-Q Academic 超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore 公司；Sigma 2-16 高速離心機(jī)：德國(guó)Sigma 離心機(jī)公司；CP214 型電子天平：廈門(mén)億辰科技有限公司；DHC-9240A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；基本型RHK/TC 加熱磁力攪拌器：IKA 儀科，德國(guó)；三聯(lián)吡啶釕：98%，TCI，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；腐胺、亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品（98%，J&K，百靈威科技有限公司）；NaH2PO4、Na2HPO4、HClO4（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；NaOH（AR，上?；瘜W(xué)試劑總廠）；HCl（AR，上海威?；瘜W(xué)有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，所用溶液需經(jīng)0.22 μm 醋酸纖維膜過(guò)濾；葡萄酒。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)前將毛細(xì)管依次用1 mol/L HCl，超純水，0.1 mol/L NaOH 沖洗10 min，然后用運(yùn)行磷酸鹽緩沖溶液平衡8 h～12 h。檢測(cè)池中采用三電極體系，工作電極為Pt 盤(pán)電極，為減小溶劑蒸發(fā)等因素的影響，每3 小時(shí)更換一次Ru（bpy）32+。光電倍增管高壓設(shè)為800 V，將毛細(xì)管進(jìn)樣管端插入緩沖液中，待發(fā)光信號(hào)基線穩(wěn)定后進(jìn)樣檢測(cè)。

樣品前處理：用0.22 μm 的醋酸纖維濾膜過(guò)濾葡萄酒得到待測(cè)樣品液，電動(dòng)進(jìn)樣后，根據(jù)其發(fā)光強(qiáng)度及線性回歸方程計(jì)算出葡萄酒中生物胺的含量，同時(shí)加入一定量的腐胺和亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)條件及毛細(xì)管電泳條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)電位的優(yōu)化

在1.0 V～1.25 V 范圍內(nèi)研究ECL 強(qiáng)度與檢測(cè)電位之間的關(guān)系，如圖1（a：2 mmol/L put 的ECL 強(qiáng)度；b：0.5 mmol/L spd 的ECL 強(qiáng)度），在光電倍增管高壓：800 V；進(jìn)樣條件：10 s×10 kV；運(yùn)行高壓：15 kV；運(yùn)行緩沖液：pH8.5，50 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液；檢測(cè)池內(nèi)Ru（bpy）32+：5 mmol/L（溶于pH8.0 磷酸鹽緩沖溶液條件下進(jìn)行檢測(cè)電位的優(yōu)化。通過(guò)逐漸升高檢測(cè)電位，發(fā)現(xiàn)在較低檢測(cè)電位（如1.05 V）下，腐胺和亞精胺的ECL 強(qiáng)度都相對(duì)較弱；當(dāng)檢測(cè)電位升至1.15 V 時(shí)，ECL信號(hào)強(qiáng)度明顯增加；在檢測(cè)電位為1.15 V 時(shí)，亞精胺的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到峰值，而腐胺的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度也接近峰值，但是當(dāng)繼續(xù)升高檢測(cè)電位，即當(dāng)電位高于1.15 V 時(shí)，腐胺的ECL 強(qiáng)度不再有明顯的升高，同時(shí)，亞精胺的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度反而呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。因此，本試驗(yàn)的最優(yōu)檢測(cè)電位選為1.15 V。

圖1 檢測(cè)電位對(duì)ECL 強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of detection potential on the ECL intensity

2.1.2 檢測(cè)池中pH 的優(yōu)化

檢測(cè)池中的pH 也是影響ECL 強(qiáng)度的一個(gè)因素。以檢測(cè)電位1.15 V，運(yùn)行高壓15 kV，緩沖液濃度為50 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液PBS 及pH 為8.5 的條件下，其余均采用系統(tǒng)默認(rèn)的各項(xiàng)值，改變檢測(cè)池中的pH 大?。╬H8.00～pH10.00）從而得到ECL 強(qiáng)度與檢測(cè)池中pH 的關(guān)系，如圖2（a：2 mmol/L put 的ECL 強(qiáng)度；b：0.1 mmol/L spd 的ECL 強(qiáng)度）。

圖2 檢測(cè)池中緩沖pH 值對(duì)ECL 強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of phosphate buffer pH in detection cell

由圖2 可知，通過(guò)逐漸升高檢測(cè)池中的pH，發(fā)現(xiàn)在pH 為7.0 時(shí)，發(fā)光性弱且分離差；從pH8.0 開(kāi)始，亞精胺的ECL 強(qiáng)度以pH9.0 為轉(zhuǎn)折點(diǎn)先上升后下降，而腐胺的ECL 強(qiáng)度在pH9.0 之前緩慢上升，在pH9.50處達(dá)到峰值；綜合考慮，檢測(cè)池中的pH 的最優(yōu)值為pH9.50。

2.1.3 運(yùn)行高壓的優(yōu)化

運(yùn)行高壓對(duì)ECL 強(qiáng)度及遷移時(shí)間的影響，見(jiàn)圖3。

圖3 運(yùn)行高壓對(duì)ECL 強(qiáng)度及遷移時(shí)間的影響Fig.3 Effect of running voltage on ECL intensity and migration time

實(shí)驗(yàn)在檢測(cè)電位：1.15V；光電倍增管高壓：800 V；進(jìn)樣條件：10 s×10 kV；運(yùn)行緩沖液：pH8.5，50 mmol/L；Ru（bpy）32+：5 mmol/L，pH8.5，50 mmol/L 緩沖液配制的條件下，通過(guò)改變運(yùn)行高壓，從9 kV～17 kV 內(nèi)研究運(yùn)行高壓對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，在運(yùn)行高壓低時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度也低；運(yùn)行高壓為13 kV 時(shí)，亞精胺的ECL 強(qiáng)度最大，然后又逐漸降低；而腐胺的ECL 強(qiáng)度基本維持在一條水平線上，變化不大，如圖3（a：2 mmol/L put 的ECL 強(qiáng)度；b：0.5 mmol/L spd 的ECL 強(qiáng)度；c：2 mmol/L put 的遷移時(shí)間；d：0.5 mmol/L spd）。

運(yùn)行高壓不僅影響被測(cè)物的遷移時(shí)間，而且對(duì)分離度、峰高都有不同程度的影響。分離電壓越高，遷移時(shí)間會(huì)越短，但產(chǎn)生焦耳熱增大，導(dǎo)致峰寬和噪聲增大，引起峰形變化。如圖3（c）和圖3（d）所示，當(dāng)分離高壓在9 kV～17 kV 范圍內(nèi)變化，腐胺遷移時(shí)間從512.50 s變?yōu)?53.33 s，亞精胺遷移時(shí)間由644.57 s 變?yōu)?08.85 s，均明顯下降；如圖3，在電壓9 kV～15 kV 變化時(shí)，亞精胺發(fā)光強(qiáng)度先增強(qiáng)，后下降，但總體趨勢(shì)仍增強(qiáng)了2 200 多，在電壓從15 kV～17 kV 變化時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度下降，但下降的變化緩慢。而且，當(dāng)電壓大于13 kV 時(shí)，由于毛細(xì)管焦耳熱的產(chǎn)生導(dǎo)致了基線噪音變大。另外，大量分析物從毛細(xì)管流入檢測(cè)池，使得電極表面Ru（bpy）32+的濃度降低，使發(fā)光效率下降。而腐胺在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度變化不大。因此，為了獲得較高的發(fā)光強(qiáng)度和較短的分析時(shí)間，綜合考慮峰寬、靈敏度、噪音、焦耳熱等因素，選擇13 kV 作為運(yùn)行高壓。

2.1.4 運(yùn)行緩沖液pH 的優(yōu)化

在檢測(cè)電位：1.15 V；光電倍增管高壓：800 V；進(jìn)樣條件：10 s×10 kV；運(yùn)行高壓：13 kV；運(yùn)行緩沖液：50 mmol/L；Ru（bpy）32+：5 mol/L，pH9.50，50 mmol/L 緩沖液配制條件下，考察pH 在5.0～10.0 范圍內(nèi)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。如圖4（a：2 mmol/L put 的ECL 強(qiáng)度；b：0.5 mmol/L spd 的ECL 強(qiáng)度；c：分離度）。

圖4 運(yùn)行緩沖液pH 對(duì)ECL 強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of running buffer running buffer concentration on ECL intensity

由圖4 可知，在pH 較小時(shí)，由于胺類(lèi)物質(zhì)質(zhì)子化，發(fā)光強(qiáng)度小；隨著pH 的增大，發(fā)光強(qiáng)度增大，當(dāng)緩沖溶液pH 為9.5 時(shí)，檢測(cè)到腐胺和亞精胺的ECL 強(qiáng)度最高。此后，隨著緩沖液pH 的增加，毛細(xì)管內(nèi)壁的硅羥基充分電離，電滲流增加顯著，腐胺和亞精胺的發(fā)光強(qiáng)度明顯減小。為保持較好的分離度和ECL 強(qiáng)度，本實(shí)驗(yàn)將緩沖液的pH 設(shè)在9.5。

2.1.5 緩沖液濃度的優(yōu)化

在檢測(cè)電位：1.15 V；光電倍增管高壓：800 V；進(jìn)樣條件：10 s×10 kV；運(yùn)行高壓：13 kV；運(yùn)行緩沖液：50 mmol/L；Ru（bpy）32+：5 mmol/L，pH9.50，50 mmol/L 緩沖液配制條件下，考察緩沖液濃度在20 mmol/L ～70 mmol/L 范圍內(nèi)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。如圖5（a：2 mmol/L put 的ECL 強(qiáng)度；b：0.5 mmol/L spd 的ECL 強(qiáng)度；c：分離度）。

圖5 運(yùn)行緩沖液濃度對(duì)ECL 強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of buffer concentration on ECL intensity

由圖5 可知，腐胺的ECL 強(qiáng)度先增強(qiáng)，在50 mmol/L處達(dá)到峰值，然后隨著緩沖液濃度的增加，發(fā)光強(qiáng)度開(kāi)始下降；亞精胺也是隨著緩沖液濃度的增加，ECL強(qiáng)度以40 mmol/L 處為峰值先增強(qiáng)，后下降，但在50 mmol/L 總體趨勢(shì)仍增強(qiáng)了1 200 多。另外，實(shí)驗(yàn)也考察了分離度，在40 mmol/L～60 mmol/L 處幾乎處于水平位置，影響不大；綜合考慮分離度和ECL 強(qiáng)度等因素，故選擇50 mmol/L 作為緩沖液濃度。

2.2 最低檢測(cè)限、線性及精密度

在最佳條件：檢測(cè)電位1.15 V，Ru（bpy）32+濃度5 mmol/L，pH9.5；進(jìn)樣條件10 s×10 kV，分離高壓13 kV，分離緩沖液為pH9.5，50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液下，對(duì)腐胺和亞精胺與ECL 強(qiáng)度之間的校準(zhǔn)曲線及最低檢出限進(jìn)行測(cè)定，并驗(yàn)證此方法的精密度，所得結(jié)果令人滿意，見(jiàn)表1。

表1 方法的線性和檢出限Table 1 The linearity of the method and detection limit

2.3 樣品測(cè)定

將自制葡萄酒用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，采用上述全部的優(yōu)化條件來(lái)對(duì)處理后的自制葡萄酒進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣檢測(cè)，見(jiàn)圖6。

從圖6 可以看出，葡萄酒樣品中的雜質(zhì)不干擾腐胺和亞精胺的測(cè)定，因此，用CE-ECL 法可直接測(cè)定該自制葡萄酒樣品中的腐胺和亞精胺的含量。由實(shí)驗(yàn)測(cè)得，該自制葡萄酒中亞精胺的含量為0.143 mmol/L，未測(cè)出腐胺。

取待測(cè)液4 份，其中1 份為未加內(nèi)標(biāo)樣品待測(cè)液，其它3 份用于進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，分別向3 份待測(cè)液添加5、10、15 μL 亞精胺標(biāo)準(zhǔn)溶液作為內(nèi)標(biāo)。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)這4 份樣品進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)未加內(nèi)標(biāo)樣品液進(jìn)行平行測(cè)定，其遷移時(shí)間和峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.13%和7.29%。對(duì)加標(biāo)樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，回收率在誤差范圍內(nèi)，效果較好。

表2 葡萄酒中亞精胺的含量及其加標(biāo)后的回收率檢測(cè)結(jié)果Table 2 Content of the wine spermidine and after prevented the recovery test results

3 結(jié)論

本文闡述了一種用毛細(xì)管電泳和電化學(xué)發(fā)光結(jié)合的方法對(duì)葡萄酒樣品中的腐胺與亞精胺含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)各種影響分離和檢測(cè)的條件進(jìn)行了細(xì)致研究。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，腐胺的最低檢出限（S/N=3）為0.1 mmol/L，線性范圍0.1 mmol/L～4 mmol/L，線性相關(guān)系數(shù)r=0.994 9；亞精胺的最低檢出限（S/N=3）可達(dá)0.05 mmol/L，線性范圍0.05 mmol/L～2 mmol/L，線性相關(guān)系數(shù)r=0.992 5，9 min 可完成檢測(cè)。利用此法對(duì)腐胺和亞精胺進(jìn)行分離檢測(cè)具有高效、高靈敏度、樣品消耗少及操作成本低的優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)食品中腐胺和亞精胺含量的可行方法。

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