聯(lián)合用藥對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

張 利 姚俊芳 吳慧麗

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聯(lián)合用藥對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

張 利 姚俊芳 吳慧麗

（河南省鄭州市中心醫(yī)院消化一科，鄭州 450007）

研究雷帕霉素聯(lián)合阿霉素對(duì)胃癌細(xì)胞（BGC-823）增殖抑制及凋亡的影響，并探討機(jī)制。細(xì)胞培養(yǎng)，通過(guò)甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測(cè)雷帕霉素（RAPA）干預(yù)組、阿霉素干預(yù)組及聯(lián)合干預(yù)組對(duì)胃癌細(xì)胞系增殖抑制作用；流式細(xì)胞儀法分別檢測(cè)各組細(xì)胞周期及凋亡率；western試驗(yàn)檢測(cè)抑癌基因p53、APC、DPC4蛋白表達(dá)水平。RAPA能抑制胃癌細(xì)胞的增殖，其促凋亡作用最弱；單獨(dú)應(yīng)用阿霉素及阿霉素聯(lián)合20.0nmol/L RAPA均可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖，且聯(lián)合應(yīng)用抑制率顯著升高（＜0.01）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示阿霉素及聯(lián)合應(yīng)用均可增加胃癌細(xì)胞的凋亡率（＜0.01）；western試驗(yàn)提示聯(lián)合應(yīng)用組p53、APC、DPC4蛋白表達(dá)水平升高。RAPA能抑制胃癌生長(zhǎng)，mTOR信號(hào)通路參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖與凋亡，mTOR信號(hào)通路抑制劑RAPA可提高抑癌基因p53、APC、DPC4蛋白表達(dá)、增強(qiáng)阿霉素的抗腫瘤效應(yīng)。

胃癌；雷帕霉素靶蛋白；信號(hào)通路；雷帕霉素；阿霉素；中醫(yī)病因

目前腫瘤治療熱點(diǎn)在分子水平，mTOR信號(hào)通路與腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，作為Akt下游的重要底物之一，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以整合氨基酸、能量、生長(zhǎng)因子所激發(fā)的信號(hào)通路，借以調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和細(xì)胞周期，通過(guò)控制其下游與翻譯、轉(zhuǎn)錄有關(guān)的多種蛋白的磷酸化來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)作用，在細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)和增殖中起中心調(diào)控作用，其轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)通路的異常與多種腫瘤的形成密切相關(guān)，是腫瘤理想的治療靶點(diǎn)之一[1]。本研究為阿霉素及其聯(lián)合mTOR信號(hào)通路抑制劑雷帕霉素，對(duì)體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞株的殺傷和抑制作用及檢測(cè)抑癌基因p53、APC、DPC4蛋白表達(dá)，并探討其機(jī)制，以期為尋找新的化療方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 doxorubicin，噻唑藍(lán)（MTT），二甲亞砜（DMSO），胎牛血清，RPMI-1640，碘化丙啶（PI），96孔培養(yǎng)板，酶聯(lián)檢測(cè)儀，流式細(xì)胞儀，CO2孵箱，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，雷帕霉素，細(xì)胞裂解液（晶美生物），western-bloting試劑盒，p53、APC、DPC4兔抗人一抗，羊抗兔二抗，Ecl試劑盒（Santa公司）5*上樣baffer，電泳和電轉(zhuǎn)槽，底片、顯影液和定影液。

1.2 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng) ①細(xì)胞株：人胃癌細(xì)胞株BGC-823（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)）；②細(xì)胞培養(yǎng)：將胃癌細(xì)胞在培養(yǎng)箱中進(jìn)行單層傳代培養(yǎng)，2d更換培養(yǎng)基1次，1∶4常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT毒性實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞96孔培養(yǎng)板貼壁后，實(shí)驗(yàn)組換成單用doxorubicin、雷帕霉素及它們的混合液，對(duì)照組加等量相同不含藥物培養(yǎng)液。藥物作用24h后，于每孔中加入配制的0.5% MTT 20μl繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，加入150μl DMSO，在混合振蕩儀上振蕩15min，使結(jié)晶物充分溶解后，于酶聯(lián)檢測(cè)儀上570nmol波長(zhǎng)，測(cè)定各孔吸光光度值。計(jì)算細(xì)胞毒性值（CT%），CT%=（1-OD處理/OD對(duì)照）×100%。分別實(shí)驗(yàn)5次，結(jié)果以平均值±標(biāo)均差表示。

1.4 流式細(xì)胞儀 檢測(cè)doxorubicin、雷帕霉素及它們的混合液對(duì)BGC-823細(xì)胞周期和凋亡的影響：取中效濃度雷帕霉素（20nmol/l）、單加阿霉素（Dox，0.3μmol/l）組及聯(lián)合組，于藥物作用24h后，分別對(duì)各樣本進(jìn)行細(xì)胞周期分析，并計(jì)算凋亡率。

1.5 Western-blot檢測(cè)p53、APC、DPC4蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞先加無(wú)血清培養(yǎng)液24h后，再按以上分組后分別加藥，收集細(xì)胞，加裂解液提取總蛋白，通過(guò)Western-blot檢測(cè)p53、APC、DPC4蛋白表達(dá)，測(cè)定積分灰度值，將p53、APC、DPC4/β-actin的比值作為蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以mean±SD表示，采用SPSS 13.0軟件，單純比較處理組與對(duì)照組之間的差別用Independend-Samples t Test。隨機(jī)區(qū)組間三者或以上計(jì)量資料的兩兩比較，用Fisher LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定細(xì)胞生存率 各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，藥物作用24h后，分別對(duì)各組吸光值和細(xì)胞抑制率進(jìn)行檢測(cè)，并列表統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示：3組均有腫瘤細(xì)胞抑制作用，以阿霉素較為明顯，且聯(lián)合作用抑制作用最為顯著。

2.2 細(xì)胞周期和凋亡的檢測(cè)結(jié)果 3組與對(duì)照組在各期、增殖指數(shù)和早期凋亡率上的比較，均有顯著差異，而阿霉素單用組與對(duì)照組比較，各期細(xì)胞比例、PI和早期凋亡率的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示雷帕霉素及其聯(lián)合應(yīng)用組藥物作用腫瘤細(xì)胞后，與對(duì)照組比較細(xì)胞處于G0–G1期的比例增多，說(shuō)明藥物作用后細(xì)胞G1期延長(zhǎng)和不增殖細(xì)胞群即G1期細(xì)胞增多，G1期延長(zhǎng)意味著細(xì)胞增殖周期延長(zhǎng)，增殖緩慢，而相對(duì)增殖期細(xì)胞減少，以聯(lián)合組最顯著；并分析含RAPA組的S期細(xì)胞比例可見(jiàn)，該期細(xì)胞明顯減少，在聯(lián)合組中更為突出。

2.3 western-blot對(duì)不同分組處理的胃癌細(xì)胞p53、APC、DPC4蛋白的檢測(cè) 對(duì)照組及處理組藥物干預(yù)腫瘤細(xì)胞24h后，裂解細(xì)胞行免疫印跡p53、APC、DPC4蛋白表達(dá)檢測(cè)，各灰?guī)е捣謩e與β-actin進(jìn)行效正。3組p53、APC、DPC4蛋白表達(dá)，阿霉素?zé)o明顯差異，雷帕霉素組較為明顯，且聯(lián)合以上表達(dá)明顯增強(qiáng)。

3 討論

胃癌屬中醫(yī)反胃、噎嗝、胃脘痛、瘕、積聚等病證范疇。對(duì)于胃癌的成因，目前的認(rèn)識(shí)主要有3個(gè)方面，一為正虛致病說(shuō)，二為熱毒致病說(shuō)，三為痰凝血瘀說(shuō)[2]。另外，氣血瘀結(jié)、精神因素、脾胃失調(diào)、飲食不節(jié)等也是常見(jiàn)的致病因素[3]。

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase，以下簡(jiǎn)稱PI3K）信息傳導(dǎo)通路的激活已被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞抗凋亡的主要機(jī)制之一[4]。Akt[5]是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。該激酶可調(diào)節(jié)對(duì)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和癌基因Ras起反應(yīng)的細(xì)胞生存信號(hào)。PI3K和其它上游激酶參與Akt的激活[6]。

目前，我們公認(rèn)的一些抑癌基因其中很多，主要與消化道腫瘤相關(guān)的有：p53、APC、DPC4，其中p53在所有惡性腫瘤中，50%以上會(huì)出現(xiàn)該基因的突變。由這種基因編碼的蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，其控制著細(xì)胞周期的啟動(dòng)。許多有關(guān)細(xì)胞健康的信號(hào)向p53蛋白發(fā)送。關(guān)于是否開(kāi)始細(xì)胞分裂就由這個(gè)細(xì)胞決定。如果這個(gè)細(xì)胞受損，又不能得到修復(fù)，則p53蛋白將參與啟動(dòng)過(guò)程，使這個(gè)細(xì)胞在細(xì)胞凋亡中死去；APC基因是由Herrera于1986年對(duì)1例格德納綜合征（葡萄糖注射液）患者進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的抑癌基因，APC基因突變將導(dǎo)致其編碼的APC蛋白的改變，產(chǎn)生截短的無(wú)活性的APC蛋白，截短APC蛋白可以通過(guò)與野生型APC基因產(chǎn)物結(jié)合而產(chǎn)生一種負(fù)顯性作用，使其不能正常地發(fā)揮生理功能，導(dǎo)致細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡調(diào)控和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)等方面的重要改變，使細(xì)胞發(fā)生癌變，DPC4是新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在消化道腫瘤，特別是胰腺癌中，約一半存在DPC4的缺失，DPC4基因參與TGF-β細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，是信號(hào)傳遞蛋白SMADs的功能中心。TGF-β的生物學(xué)效應(yīng)都是Smad4與通路中不同蛋白連接作用的結(jié)果。

作為Akt下游的重要底物之一，mTOR是一種跟PI3K/Akt通路相關(guān)的蛋白激酶，能通過(guò)磷酸化激活與mRNA翻譯相關(guān)的蛋白p70S6K等來(lái)增強(qiáng)mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，也能通過(guò)磷酸化滅活翻譯抑制蛋白4EBP1等。Akt通過(guò)磷酸化mTOR的Ser2448位點(diǎn)而激活mTOR，提高mRNA翻譯的效率，從而增加一系列與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化相關(guān)蛋白的表達(dá)，加快了腫瘤的發(fā)生。Akt/mTOR通道有：①抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生存；②促進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行；③提高血管內(nèi)皮因子表達(dá)，促進(jìn)血管形成；④促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等。

進(jìn)展期腫瘤的治療問(wèn)題，主要是手術(shù)切除和解決腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖，而對(duì)細(xì)胞調(diào)控點(diǎn)的抑制作用是解決細(xì)胞增殖的關(guān)鍵，細(xì)胞周期的調(diào)控點(diǎn)有3個(gè)：G1期控制點(diǎn)，S期及M期控制點(diǎn)。此次試驗(yàn)結(jié)果提示，RAPA可調(diào)控胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)周期，作用點(diǎn)主要是對(duì)G1期控制點(diǎn)，聯(lián)合阿霉素可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖，并可以增加阿霉素細(xì)胞毒性效果，細(xì)胞凋亡明顯增強(qiáng)。結(jié)合western-blot檢測(cè)結(jié)果，我們可以推出，通過(guò)抑制雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通道，直接或間接增強(qiáng)了一些抑癌基因如p53、APC、DPC4的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通道可通過(guò)調(diào)控抑癌基因，參與胃癌細(xì)胞的增殖與凋亡，雷帕霉素可增強(qiáng)阿霉素的抗腫瘤效應(yīng)。

[1] Lang SA, Gaumann A, KoehlGE, et al. Mammalian target of rapamycin is activated in hum an gastric cancer and serves as a target for therapy in an experim entalm odel[J]. Int J Cancer,2007,120(8):1803-1810.

[2] 劉成林,劉麗萍.胃癌的中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合治療進(jìn)展[J].山東中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1994,18(3):209.

[3] 劉友章,于向民.胃癌的中醫(yī)藥臨床研究進(jìn)展[J].新中醫(yī),1996,28(12):51.

[4] Cantley LC. The phosphoinositide 3-kinase pathway[J]. Science, 2002,296 (5573):1655-1657.

[5] Nicholson KM, Anderson NG. The protein kinase B/Akt signalling pathway in human malignancy[J]. Cell Signal,2002,14:381-395.

[6] Garg A, Aggarwal BB. Nuclear transcription factor-kappaB as a target for cancer drug development[J]. Leukemia,2002,16(6):1053-68.

（本文校對(duì)：蘇玲 收稿日期：2012-02-05）

10.3969/j.issn.1672-2779.2012.06.076

1672-2779（2012）-06-0116-02