細(xì)胞穿透肽BDNF融合蛋白研究進(jìn)展

魯吉珂，楊艷坤，司艷紅，關(guān)方霞

(鄭州大學(xué)生物工程系 河南 鄭州 450001)

帕金森病(Parkinson’s Diease，PD)是中老年人常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病，其發(fā)生與黑質(zhì)紋狀體中多巴胺含量減少有關(guān)。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)屬神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(Neurotrophin)家族成員，能夠促進(jìn)多種神經(jīng)元的存活，尤其對(duì)多巴胺能神經(jīng)元有很強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用，并參與PD的發(fā)病與病理進(jìn)程，被認(rèn)為是治療PD的新一代藥物［1］。但因?yàn)锽DNF為大分子物質(zhì)，不能透過(guò)血腦屏障，腦室內(nèi)用藥又極其不方便，給臨床的應(yīng)用帶來(lái)很大困難。

蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域家族是自然界中天然存在的一類多肽，能夠安全高效地實(shí)現(xiàn)多種外源生物大分子的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)［2］。構(gòu)建轉(zhuǎn)導(dǎo)肽與BDNF融合蛋白，可實(shí)現(xiàn)BDNF跨膜運(yùn)輸并達(dá)到對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療目的，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較多。本文從細(xì)胞穿透肽和BDNF融合蛋白的國(guó)內(nèi)外研究方面展開綜述，旨在為開發(fā)基于BDNF融合蛋白相關(guān)藥物研究提供參考。

1 細(xì)胞穿透肽

細(xì)胞穿透肽(Cell penetrating peptide，CPP)，又稱蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(Protein tansduction domain，PTD)，是一類具有跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的小分子肽段，能以非能量、非受體依賴性的方式把生物大分子跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)入各種細(xì)胞內(nèi)［3］。目前已發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞穿透肽主要包括人類免疫缺陷病毒1型(Human imunodeficiency virus type 1，HIV-1)編碼的反式轉(zhuǎn)錄激活因子TAT、果蠅同源異型轉(zhuǎn)錄因子ANTP、單純皰疹病毒1型(HSV-1)轉(zhuǎn)錄因子VP22和人工合成的多聚精氨酸及多聚賴氨酸等［2］。

CPP一般分為3類:蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域PTD，模型多肽和設(shè)計(jì)多肽。PTD是來(lái)源于特定天然蛋白片段具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的肽段，如TAT;模型多肽是模仿已知結(jié)構(gòu)CPPs的氨基酸序列，如多精氨酸;設(shè)計(jì)多肽是根據(jù)特定需要設(shè)計(jì)不同來(lái)源多肽片段［4］。不同來(lái)源的CPP并沒(méi)有相似的氨基酸序列，其共同點(diǎn)是為正電荷或兩性分子［4］。滿足實(shí)際應(yīng)用的CPP分子應(yīng)當(dāng)滿足下列條件:①小分子，易于合成;②易于和多種分子結(jié)合，不改變其轉(zhuǎn)導(dǎo)性能;③對(duì)組織、細(xì)胞具有較高的選擇性;④穩(wěn)定性好，毒性及副作用?。?］。

CPP及其結(jié)合的生物大分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)是目前研究的熱點(diǎn)，截至2012年3月13日，Pubmed中題目或摘要中含有CPP的文獻(xiàn)有523篇，研究較多集中在TAT和ANTP上，見(jiàn)表1。據(jù)法國(guó)學(xué)者 Vivès在2008年的報(bào)道，關(guān)于TAT和ANTP的文獻(xiàn)占CPP的文獻(xiàn)75%以上［5］。值得注意的是，作為一種藥物運(yùn)輸體系，CPP分子的毒性必須要考慮。目前體外毒性研究較多，而活體毒性報(bào)道相對(duì)較少。盡管尚未發(fā)現(xiàn)CPP的毒性和不良反應(yīng)，但英國(guó)學(xué)者Bolton等報(bào)道稱當(dāng)10μg或者更高劑量的跨膜肽注射大鼠時(shí)，可檢測(cè)到腦細(xì)胞炎癥和神經(jīng)細(xì)胞死亡現(xiàn)象，而劑量降低到1 μg時(shí)，上述效應(yīng)大大降低［6］。

表1 Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)文獻(xiàn)檢索結(jié)果

2 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)

BDNF是1982年德國(guó)神經(jīng)生物學(xué)家Barde等從豬腦中分離出來(lái)的小分子蛋白質(zhì)，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。BDNF不僅對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育、增殖分化、存活起重要作用，而且對(duì)神經(jīng)元損傷后的再生修復(fù)與功能重塑也起了重要作用［7，8］。因此，BDNF 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如PD的治療上有重要的應(yīng)用前景。但應(yīng)用BDNF治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病時(shí)，主要存在2個(gè)問(wèn)題。一是人BDNF天然含量極低，每千克組織僅可提取得到微克水平的BDNF，目前尚未找到豐富的組織來(lái)源［9］;另一方面，由于存在血腦屏障，BDNF無(wú)法進(jìn)入大腦發(fā)揮生物活性，限制了其應(yīng)用。腦內(nèi)直接注射BDNF需反復(fù)給藥、易造成顱內(nèi)感染，直接應(yīng)用攜帶BDNF基因的質(zhì)粒存在表達(dá)不足，而腺病毒又存在安全隱患問(wèn)題［10］。

通過(guò)基因工程手段來(lái)制備高純度BDNF，成本較低，有望解決BDNF來(lái)源問(wèn)題。結(jié)合細(xì)胞穿透肽跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，采用基因工程方法表達(dá)并純化得到BDNFPTD融合蛋白，將具有治療作用的BDNF透過(guò)血腦屏障而發(fā)揮生物效能，有望解決BDNF給藥問(wèn)題。關(guān)于BDNF-PTD融合蛋白研究，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)較多，如裴明軍等［8］構(gòu)建含PTD與 BDNF融合基因的質(zhì)粒，并在大腸肝菌中表達(dá)，PCR擴(kuò)增PTD-BDNF融合基因，經(jīng)DNA測(cè)序無(wú)誤后插入表達(dá)質(zhì)粒pJW2構(gòu)建質(zhì)粒pJPB，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進(jìn)行PTD-BDNF蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化。石秦東等［8］構(gòu)建以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)為報(bào)告基因的BDNF融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒，并對(duì)其表達(dá)和定位進(jìn)行研究［11］。英文期刊中關(guān)于BDNF融合蛋白文獻(xiàn)相對(duì)較少，Zhou等［12］將人BDNF與PTD融合表達(dá)后，并重點(diǎn)對(duì)融合蛋白PTD-BDNF對(duì)小鼠腦損傷的保護(hù)作用進(jìn)行研究。關(guān)于BDNF的文獻(xiàn)總結(jié)見(jiàn)表2。但總的來(lái)說(shuō)，目前關(guān)于BDNF的文獻(xiàn)仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，臨床應(yīng)用的報(bào)道非常少。

表2 關(guān)于BDNF融合蛋白相關(guān)文獻(xiàn)總結(jié)

3 融合蛋白表達(dá)載體構(gòu)建

目前融合蛋白表達(dá)載體研究集中在原核表達(dá)載體，如pET系列，pTAT等。這些表達(dá)載體部分為直接商品化產(chǎn)品，部分為研究者自行構(gòu)建。真核表達(dá)載體研究相對(duì)較少，此外，還有一部分化學(xué)合成的融合蛋白。原核表達(dá)簡(jiǎn)單快捷，表達(dá)量大，有多種載體和菌種可供選擇，可以多個(gè)基因一起表達(dá)，技術(shù)也較為成熟，但其缺點(diǎn)是無(wú)法對(duì)蛋白進(jìn)行翻譯后的修飾，一些來(lái)源于高級(jí)生物的蛋白在原核系統(tǒng)中無(wú)法正常折疊，以包涵體的形式存在，需要復(fù)雜的蛋白復(fù)性過(guò)程;真核表達(dá)載體具有轉(zhuǎn)錄后加工功能，產(chǎn)物以可溶活性蛋白形式存在，提取純化成本較低，但其表達(dá)量相對(duì)較低，周期較長(zhǎng)，載體價(jià)格也較貴［15］。

化學(xué)交聯(lián)的融合蛋白其結(jié)構(gòu)便于控制，有利于研究其結(jié)構(gòu)與膜穿透機(jī)理。另外，化學(xué)交聯(lián)法可制備多種結(jié)構(gòu)的新型CPP融合蛋白，如含有非基因編碼氨基酸D-氨基酸的融合蛋白，但該方法目前研究較少［16］。關(guān)于融合蛋白相關(guān)表達(dá)載體構(gòu)建的文獻(xiàn)總結(jié)見(jiàn)表3。

4 細(xì)胞靶向穿膜肽

CPP能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)各種生物大分子進(jìn)入各類細(xì)胞，但因缺乏細(xì)胞特異性，有可能對(duì)正常組織和細(xì)胞造成毒害作用。通過(guò)細(xì)胞靶向肽(Cell-targeting peptides)，可提高多肽的細(xì)胞特異性。因此將靶向載體與CPP結(jié)合起來(lái)，尋求具有靶向作用的CPP并構(gòu)建融合蛋白，可結(jié)合兩者優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)靶向和跨膜兩種功能，是未來(lái)研究的一個(gè)方向［5］。李海玉等［34］成功構(gòu)建了基于細(xì)胞穿透肽的蛋白表達(dá)運(yùn)輸載體pET14b-HC(L)NE(pET14b-His-CPP-Linker-NLS-EGFP)，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示得到融合蛋白可快速穿透細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞核;該蛋白表達(dá)載體具有細(xì)胞穿透肽靶向細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)淖饔谩窍蛄岬龋?5］將能夠靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的凋亡素VP3，構(gòu)建到內(nèi)化活性得到提高的改良型穿透肽載體上，構(gòu)建pET14b-VP3-EGFP-TAT表達(dá)載體，得到了具有促凋亡活性的融合蛋白。

5 小結(jié)及展望

目前關(guān)于CPP的研究主要集中在以下3個(gè)方面:①研究CPP結(jié)構(gòu)，揭示其跨膜原因，進(jìn)而研究發(fā)現(xiàn)新的具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的CPP，并提高其跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。如 Eiríksdóttir等［33］對(duì)10種常用 CPP 分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較進(jìn)行研究，考察了CPP對(duì)磷脂膜的作用，并據(jù)此對(duì)CPP分子進(jìn)行重新分類;②CPP跨膜機(jī)理研究，該部分研究文獻(xiàn)較多，但尚未有統(tǒng)一的結(jié)論;③拓展CPP在生物大分子物質(zhì)跨膜運(yùn)輸中的應(yīng)用［23，30］。

綜上所述，細(xì)胞穿透肽是一種有力的跨膜工具，將其與靶向肽結(jié)合起來(lái)，構(gòu)建具有靶向作用的CPP-BDNF融合蛋白，有助于BDNF透過(guò)血腦屏障，直接靶向運(yùn)送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，從而為PD治療提供新思路。

［1］閆穎，趙詠梅.腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與帕金森病治療研究進(jìn)展［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011，31(3):527-530.

［2］吳永紅，張成崗.HIV-1 TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生物工程雜志，2010，30(10):66-73.

［3］董曉，王家寧.細(xì)胞穿透肽PEP-1在蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)中的應(yīng)用［J］.藥物生物技術(shù)，2007，14(2):146-148.

［4］Zorko M，Langelü.Cell-penetrating peptides:mechanism and kinetics of cargo delivery［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2005，57(4):529-545.

［5］Vivès E，Schmidt J，Pèlegrin A.Cell-penetrating and cell-targeting peptides in drug delivery［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2008，1786(2):126-138.

［6］Bolton S J，Jones D N C，Darker J G，et al.Cellular uptake and spread of the cell-permeable peptide penetratin in adult rat brain［J］.European Journal of Neuroscience，2000，12(8):2847-2855.

［7］王海珍，張?jiān)茲h，趙莘瑜，等.TAT-BDNF載體構(gòu)建及融合蛋白表達(dá)［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2008，29(18):1-4.

［8］裴明軍，范清林，宋禮華.PTD-BDNF融合基因克隆、表達(dá)和純化［J］.生物學(xué)雜志，2005，22(2):21-23.

［9］馬蕾蕾.TAT-BDNF融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及其純化［D］.廣州:第一軍醫(yī)大學(xué)，2006.

［10］歐陽(yáng)長(zhǎng)杰.BDNF基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及BDNF-GFP融合蛋白對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化影響的研究［D］.徐州:徐州醫(yī)學(xué)院，2008.

［11］石秦東，張蓬勃，田玉梅，等.腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009，30(2):141-144.

［12］Zhou J P，F(xiàn)eng Z G，Yuan B L，et al.Transduced PTD-BDNF fusion protein protects against beta amyloid peptide-induced learning and memory deficits in mice［J］.Brain Research，2008，1191:12-19.

［13］鄭國(guó)璽，?？?，杜小瀅，等.hBDNF原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2008，37(2):133-135.

［14］蔣暉，金大地，魯凱伍，等.新型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子TAT-BDNF生物合成及生物活性研究［J］.中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志，2006，24(3):325-328.

［15］劉志剛，朱健琦，黃海珍，等.真核表達(dá)與原核表達(dá)的德國(guó)小蠊變應(yīng)原Bla g 2蛋白結(jié)構(gòu)的光譜學(xué)研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2006，26(5):879-883.

［16］Yu H-H，Nakase I，Pujals S，et al.Expressed protein ligation for the preparation of fusion proteins with cell penetrating peptides for endotoxin removal and intracellular delivery［J］.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes，2010，1798(12):2249-2257.

［17］吳永紅，石錦平，何國(guó)維，等.TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽介導(dǎo)的秀麗線蟲體內(nèi)外源蛋白的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)研究［J］.中國(guó)生物工程雜志，2011，31(3):39-45.

［18］汪飛鵬，桂向東，宋禮華.hCu，Zn-SOD-TAT PTD融合基因的構(gòu)建和表達(dá)［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39(6):432-435.

［19］李素芹，潘英，潘明潔，等.帶有HIV Tat-蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的人成熟神經(jīng)生長(zhǎng)因子的分泌表達(dá)及鑒定［J］.藥物生物技術(shù)，2009，16(4):291-295.

［20］潘勇昭，陳虹，王欣，等.重組EpoAB-NGF模擬肽的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能［J］.中國(guó)生物工程雜志，2011，31(1):1-5.

［21］董曉，王家寧，黃永章，等.細(xì)胞穿透肽PEP-1介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞［J］.癌癥，2007，26(2):216-219.

［22］Dietz G P H，Valbuena P C，Dietz B，et al.Application of a bloodbrain-barrier Vpenetrating form of GDNF in a mouse model for Parkinson＇s disease［J］.Brain Research，2006，1082(1):61-66.

［23］Nagel F，F(xiàn)alkenburger B H，Tnges L，et al.Tat-Hsp70protects dopaminergic neurons in midbrain cultures and in the substantia nigra in models of Parkinson’s disease［J］.Journal of Neurochemistry，2008，105(3):853-864.

［24］Katsura K-i，Takahashi K，Asoh S，et al.Combination therapy with transductive anti-death FNK protein and FK506 ameliorates brain damage with focal transient ischemia in rat［J］.Journal of Neurochemistry，2008，106(1):258-270.

［25］Tinega A N，Pell R，Kang'a S，et al.Fusion of a cell penetrating peptide from HIV-1 TAT to the Theileria parva antigen Tp2 enhances the stimulation of bovine CD8+T cell responses［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2009，130(1-2):107-113.

［26］Lea N C，Buggins A G S，Orr S J，et al.High efficiency protein transduction of quiescent and proliferating primary hematopoietic cells［J］.Journal of Biochemical and Biophysical Methods，2003，55(3):251-258.

［27］Kim D，Jeon C，Kim J H，et al.Cytoplasmic transduction peptide(CTP):New approach for the delivery of biomolecules into cytoplasm in vitro and in vivo［J］.Experimental Cell Research，2006，312(8):1277-1288.

［28］Kwon J H，Kim J B，Lee K H，et al.Protective effect of heat shock protein 27 using protein transduction domain-mediated delivery on ischemia/reperfusion heart injury［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，363(2):399-404.

［29］Lim K S，Won Y W，Park Y S，et al.Preparation and functional analysis of recombinant protein transduction domain-metallothionein fusion proteins［J］.Biochimie，2010，92(8):964-970.

［30］Cai B，Lin Y，Xue X H，et al.TAT-mediated delivery of neuroglobin protects against focal cerebral ischemia in mice［J］.Experimental Neurology，2011，227(1):224-231.

［31］Sacco E，Metalli D，Spinelli M，et al.Novel RasGRF1-derived Tatfused peptides inhibiting Ras-dependent proliferation and migration in mouse and human cancer cells［J］.Biotechnology Advances，2012，30(1):233-243.

［32］Eto Y，Yoshioka Y，Asavatanabodee R，et al.Transduction of adenovirus vectors modified with cell-penetrating peptides［J］.Peptides，2009，30(8):1548-1552.

［33］Eiríksdóttir E，Konate K，Langel U，et al.Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion［J］.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes，2010，1798(6):1119-1128.

［34］李海玉，郭愛(ài)華，劉志鋒，等.細(xì)胞穿透肽核靶向運(yùn)輸?shù)鞍妆磉_(dá)載體的構(gòu)建及其蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的研究［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26(10):1394-1399.

［35］吳向玲，劉蕓，鄧鵬，等.穿透肽TAT融合表達(dá)載體的優(yōu)化及其靶向應(yīng)用的初步研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2010，30(6):642-646.