氨基糖苷類藥物誘導(dǎo)大腸埃希菌生物被膜對抗菌藥物敏感性變化規(guī)律

陳朝喜，劉雅紅

（1．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)教研室，廣東廣州510642；2．西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理學(xué)教研室，四川成都610041）

氨基糖苷類藥物誘導(dǎo)大腸埃希菌生物被膜對抗菌藥物敏感性變化規(guī)律

陳朝喜1，2，劉雅紅1＊

（1．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)教研室，廣東廣州510642；2．西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理學(xué)教研室，四川成都610041）

采用濃度梯度遞增法對3株不同生物被膜形成能力的大腸埃希菌進(jìn)行4種氨基糖苷類藥物（阿米卡星、鏈霉素、慶大霉素和安普霉素）誘導(dǎo)，考察大腸埃希菌生物被膜對其余8種不同抗菌藥物最小抑菌濃度和最小膜清除濃度的變化規(guī)律。結(jié)果表明，在氨基糖苷類藥物誘導(dǎo)壓力下，3株不同生物被膜形成能力的菌株對其余8種抗菌藥物的最小膜清除濃度比最小抑菌濃度至少增加8倍以上，與誘導(dǎo)前相比，大腸埃希菌形成生物被膜后，其最小膜清除濃度增加的速率比最小抑菌濃度快。

濃度梯度遞增法；最小抑菌濃度；最小膜清除濃度；誘導(dǎo)壓力；大腸埃希菌

廣泛而持續(xù)的抗生素壓力下，細(xì)菌除了改變血清型、毒力因子和系統(tǒng)發(fā)生背景來逃避抗生素和機體免疫系統(tǒng)的清除外，還能通過改變生存模式（生物被膜的形成）得以繼續(xù)生存［1］。體外試驗表明生物被膜形成后具有強大的耐藥屏蔽作用［2］。本研究主要考察在不同濃度的氨基糖苷類藥物誘導(dǎo)壓力下，不同生物被膜形成能力的大腸埃希菌在形成生物被膜前后，抗菌藥物對其最小抑菌濃度（MIC）和最小膜清除濃度（MBEC）的變化規(guī)律，了解在生物被膜和浮游狀態(tài)下，細(xì)菌對抗菌藥物敏感性的變化，為進(jìn)一步探討生物被膜導(dǎo)致的耐藥機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 藥物 安普霉素、新霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星、頭孢噻呋、鏈霉素、阿米卡星、阿莫西林、氟苯尼考、利福平和卡那霉素12種抗菌藥物由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗藥廠饋贈，配成濃度為5 120 μg／m L母液備用。

1．1．2 菌株 3株細(xì)菌（E58，E53，N7）具有不同的生物被膜形成能力且對試驗中的抗菌藥物均敏感，對其進(jìn)行4種氨基糖苷類藥物（鏈霉素、慶大霉素、安普霉素和阿米卡星）梯度遞增誘導(dǎo)耐藥后，對達(dá)到64 MIC耐藥水平的耐藥株作3次無誘導(dǎo)藥物傳代培養(yǎng)后確定其耐藥后備用，分別命名為E58－64MIC，E53－64MIC 和 N7－64MIC。大 腸 埃 希 菌 標(biāo) 準(zhǔn) 株ATCC25922為本實驗室保存。

1．1．3 試劑和儀器 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂，MH肉湯培養(yǎng)基，LB肉湯培養(yǎng)基，蛋白胨大豆肉湯，葡萄糖等為廣州環(huán)凱生物科技有限公司產(chǎn)品；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為美國Corning公司產(chǎn)品；ELX800型酶標(biāo)儀為美國Bio－Tek公司產(chǎn)品；微量振蕩器為廣州神華生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1．2 方法

1．2．1 藥敏試驗 按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）推薦的微量肉湯稀釋法操作程序進(jìn)行［3］，具體操作步驟如下：用12通道移液槍將滅菌MH肉湯加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，然后將配制好的藥液母液分別加入第1列的各孔，每孔100μL，之后用多通道移液槍反復(fù)吹打混勻藥物后取100μL移至第2列，依次稀釋至第11列，這樣每列的藥物濃度分別依次做2倍稀釋。每個藥做3個重復(fù)。將用LB肉湯37℃靜止培養(yǎng)過夜的菌液調(diào)整至0．5麥?zhǔn)媳葷岫?，MH肉湯1∶1 000稀釋后，在第1列至第11列各孔每孔中各加100μL，使得第1列至第11列各列藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0．5、0．25、0．125μg／m L。密封后置恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育16 h～20 h后判斷結(jié)果。

1．2．2 生物被膜表型分析 參考文獻(xiàn)［4］方法進(jìn)行。具體操作步驟如下：在無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入200μL經(jīng)1∶100稀釋的菌液，陰性對照孔只加入相應(yīng)量的TSB肉湯，37℃培養(yǎng)24 h，然后棄去每孔內(nèi)培養(yǎng)液并用250μL滅菌PBS溶液漂洗3次以徹底棄去孔內(nèi)未黏附的浮游菌，孔壁上黏附的細(xì)菌用200μL 990 m L／L甲醇固定15 min后，棄去甲醇，室溫下自然風(fēng)干。200μL 20 g／L結(jié)晶紫染色5 min，然后將96孔微量培養(yǎng)板浸沒在流動的自來水下沖洗干凈多余的染料。待微孔板過夜自然風(fēng)干后，結(jié)合在孔內(nèi)的染料用160μL 330 m L／L冰乙酸溶解，用酶標(biāo)儀測定各孔的OD570 nm值。每個細(xì)菌接種4孔，每菌3次重復(fù)。根據(jù)測試孔與陰性對照孔OD570 nm比值的不同，將所分離大腸埃希菌的生物被膜表型分為4個表型，即無成膜能力（－），弱成膜能力（＋），中等成膜能力（＋＋）和強成膜能力（＋＋＋）。

1．2．2 生物被膜抗菌藥物敏感性試驗

1．2．2．1 生物被膜的培養(yǎng) 將臨床分離菌株N7、E58和E53在麥康凱培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單個菌落至3 m L TSB肉湯中培養(yǎng)12 h～16 h，以標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁転閷φ?，用TSB肉湯將之調(diào)整為1．0麥?zhǔn)媳葷岫龋?×108cfu／m L～2×108cfu／m L）后用TSB溶液1∶100倍稀釋，取200μL稀釋液加入96孔平底組織培養(yǎng)板37℃培養(yǎng)24 h后即形成生物被膜。

1．2．2．2 最小膜殺菌濃度（MBEC）測定 參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行生物被膜殺菌濃度的測定，其操作步驟具體如下：用滅菌PBS液或生理鹽水輕輕清洗96孔板各孔3次以徹底去除各孔內(nèi)的浮游菌，同時保證各孔底部的生物被膜不受破壞，然后在第1至11列各孔分別加200μL 含有1 024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg／m L濃度梯度的抗菌藥物，第12列各孔加不含藥物的TSB培養(yǎng)基，醫(yī)用膠布將96孔微孔板的四個角密封，用ELX800型酶標(biāo)儀測定OD600 nm值后放置恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后測定第2次OD600 nm，同時以添加空白TSB培養(yǎng)基的孔作為陰性對照，以添加菌液不加藥物的孔作為陽性對照。MBEC是指24 h內(nèi)OD600 nm值變化率為陽性孔變化值10%的孔對應(yīng)的最低藥物濃度。

1．2．3 氨基糖苷類藥物壓力下3株大腸埃希菌對8種抗菌藥物的MIC和MBEC變化規(guī)律的研究 參考1．2．2．1和1．2．2．2的方法進(jìn)行，將3株細(xì)菌經(jīng)64 MIC濃度的氨基糖苷類藥物誘導(dǎo)后的菌株對其余8抗菌藥物的MIC和MBEC進(jìn)行測定，分析在相同濃度的同類抗菌藥物壓力下，各菌株對其余8種抗菌藥物的敏感性變化規(guī)律。

2 結(jié)果

2．1 藥敏試驗和生物被膜形成能力分析

3株細(xì)菌（E58，E53，N7）對實驗中的抗菌藥物均敏感，其中分離到的3株大腸埃希菌N7具有中等成膜能力，E58和E53具有弱成膜能力。

2．2 氨基糖苷類藥物誘導(dǎo)壓力下大腸埃希菌對其余8種抗菌藥物的MIC和MBEC變化規(guī)律

經(jīng)過4種氨基糖苷類藥物（鏈霉素，慶大霉素，阿米卡星和安普霉素）遞增濃度誘導(dǎo)后，試驗結(jié)果如表1所示。在64 MIC的誘導(dǎo)藥物壓力下，3株細(xì)菌對4種誘導(dǎo)藥物均產(chǎn)生耐藥性，同時對其余8種藥物也產(chǎn)生不同程度的交叉耐藥性。從表1中看出，在引起對本身誘導(dǎo)藥物的MIC值升高外，對其余8種藥物的MIC也不同程度地升高，同時各菌株對抗菌藥物的MBEC幾乎均增加128倍，主要表現(xiàn)在MBEC值均達(dá)到1 024μg／m L以上。不同生物被膜形成能力的菌株對其余8種抗菌藥物的最小膜清除濃度比最小抑菌濃度均增加至少8倍以上，與誘導(dǎo)前相比，大腸埃希菌最小膜清除濃度增加的速率比最小抑菌濃度快。

3 討論

生物被膜不僅是細(xì)菌存在于自然界的一種重要的生存形式，而且生物被膜的形成是細(xì)菌的重要耐藥機制之一。生物被膜細(xì)菌無論在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性及致病特點等都與浮游菌有顯著的不同，表現(xiàn)為細(xì)菌的毒力下降，因為各種毒素被包裹在細(xì)菌生物被膜的下面難以釋放，并且處于惡劣的環(huán)境下細(xì)菌的代謝低下；對抗生素的防護(hù)能力增強，因為一般的抗生素都無法進(jìn)入細(xì)菌生物被膜；能避免細(xì)菌與巨噬細(xì)胞及免疫球蛋白的相互作用，激活補體的能力也降低，與生物體可呈“共生狀態(tài)”［6］。

MIC作為抗生素體外敏感試驗的標(biāo)準(zhǔn)，是評價抗生素對浮游細(xì)菌抗菌活性的指標(biāo)，長久以來為急性感染臨床合理選擇抗生素提供參考。然而對于由生物被膜引起的慢性感染和生物材料相關(guān)性感染，以MIC來指導(dǎo)抗感染治療并不適用，因為生物被膜作為高密度群體，其濃度已經(jīng)達(dá)到1011cfu／m L，因此利用MBEC作為評價生物被膜菌對抗菌藥物的敏感性比MIC更具有說服力，對合理選擇抗菌藥物和評價新型抗生物被膜藥物具有重要價值。

在本試驗中，雖然菌株E58和E53具有相同的成膜能力表型，但是在相同濃度和種類的抗菌藥物壓力下，使用的抗菌藥物對大腸埃希菌分離株的生

物被膜形成能力表現(xiàn)出不同的效應(yīng)，結(jié)果與Perez－Giraldo C等的相關(guān)研究報道一致［7］。在不同氨基糖苷類藥物誘導(dǎo)前，各菌株的MIC值與MBEC值差別至少8倍（如卡那霉素對E53菌株）；經(jīng)藥物誘導(dǎo)后，各菌株MBECs值比MIC增加速度更快，主要表現(xiàn)在當(dāng)菌株對其他抗菌藥物的MIC值未達(dá)到1 024μg／m L之前，其 MBEC值均已經(jīng)達(dá)到1 024 μg／m L以上。

表1 氨基糖苷類藥物誘導(dǎo)壓力下大腸埃希菌生物被膜對抗菌藥物的MIC和MBEC變化Table1 Changes of MIC and MBEC of E.coli biofilm to antibacterial agents under aminoglycoside induction pressures

造成多種抗菌藥物對大腸埃希菌產(chǎn)生多種不同的生物被膜能力表型的原因，與多種抗菌藥物相互影響有很大的直接關(guān)系，這就為我們后續(xù)研究不同藥物對細(xì)菌生物被膜形成能力的影響機制提供一個較好的思路。

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［3］ Cinical and Laboratory Standards Institute．Performance standards for antimicrobial susceptibility testing，Twentieth informational supplement［EM／2］．2010－1－7．http：／／ www．clsi．org／source／orders／Product ＿ Display． cfm？ section ＝Shop＆task＝3＆CATEGORY＝AST＆PRODUCT＿TYPE＝SALES＆SKU＝M100S20．

［4］ 陳朝喜，朱恒乾，廖曉萍，等．大腸埃希菌耐藥譜型、基因型和生物膜表型關(guān)系研究［J］．動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（4）：59－62．

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［7］ Perez－Giraldo C．Moxifloxacin and biofilm production by coagulase－negativestaphylococci［J］．Chemotherapy，2004，50：101－104．

Antibacterial Agent Sensitivity Changes ofE．coliBiofilm Under Induction Pressure of Aminoglycoside Drugs

CHEN Chao－xi1，2，LIU Ya－h(huán)ong1

（1．CollegeofVeterinaryMedcine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou，Guangdong，510642，China；2．CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu，Sichuan，610041，China）

To investigate the changes of minimal inhibitory concentrations（MIC）and minimal biofilm eradiation concentrations（MBEC）of three different biofilm－forming abilityE．colito other eight different antibioctics after theE．colibiofilm formation，the concentration gradient increasing induction method was used for our study under the pressures of four aminoglycoside drugs（amikacin，streptomycin，gentamicin and apramycin）．The results showed that under the different concentrations of aminoglycoside drugs，MIC and MBEC of the induced strains increased at least 8 times compared with the pre－induced strains，and the increase rate of MBEC was faster than that of MIC after theE．colibiofilm formation．

concentration gradient increasing method；minimal inhibitory concentration （MIC）；minimal biofilm eradiation concentration；induction pressure；E．coli

S852．612

A

1007－5038（2012）06－0052－04

2012－02－16

國家自然科學(xué)基金（U0631006）；西南民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項基金（11NZYTD02）

陳朝喜（1980－），男，河南唐河人，博士，主要從事獸藥殘留檢測及細(xì)菌耐藥機制研究。＊通訊作者