黃河三角洲地區(qū)PRRSV的分離鑒定及ORF4、ORF5基因遺傳特性分析

吳憶春

（山東濱州職業(yè)學院生物工程學院，山東濱州256603）

黃河三角洲地區(qū)PRRSV的分離鑒定及ORF4、ORF5基因遺傳特性分析

吳憶春

（山東濱州職業(yè)學院生物工程學院，山東濱州256603）

采集黃河三角洲地區(qū)某豬場發(fā)生高熱癥死亡的仔豬病料，處理后接種Marc－145細胞，傳代2代以后出現(xiàn)明顯細胞病變，其病毒TCID50為10－4．625／m L，采用PCR檢測細胞培養(yǎng)物中偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒，均為陰性。采用第2代細胞培養(yǎng)物人工感染仔豬，仔豬出現(xiàn)高熱、咳嗽、發(fā)紺、耳朵發(fā)紫、死亡等臨床表現(xiàn)，剖檢發(fā)病豬可見明顯的間質性肺炎表現(xiàn)，采集肺、脾、腎和淋巴結等組織進行PCR檢驗，均能檢測到PRRSV，初步認為分離到一株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒，命名為HSJ－1102株。對該分離株ORF4、ORF5基因進行擴增與克隆測序，序列分析表明，該分離株ORF4基因序列與JXA1、Ch1－a等毒株的同源性較高，在97．4%～99．3%之間，與VR2332等毒株同源性低于90%；分離株ORF5基因序列與JXA1等毒株同源性為97%～99．8%，與Ch1－a，VR2332等毒株同源性較低，分別為92．5%和86．4%。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；分離鑒定；ORF4；ORF5

自1989年首次報道豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）病例以來，PRRS已經成為影響?zhàn)B豬業(yè)的重慶疫病，在全世界范圍內造成巨大經濟損失［1］。目前，現(xiàn)有疫苗尚不能完全有效地控制所有或大部分豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）流行毒株，這與病毒的高變異性、病毒對宿主先天免疫反應的潛在影響、豬個體免疫反應的差異性等多方面因素有關。20多年來，人們對PRRSV的感染方式、致病機制與免疫預防進行了不懈的研究，但由于PRRSV的高變異性等原因，研究過程中仍然存在著大量的難題［2－3］。本試驗從黃河三角洲地區(qū)某豬場發(fā)生高熱癥死亡的仔豬采集病料，進行了PRRSV的分離鑒定及ORF4、ORF5基因的克隆與序列分析，為開展PRRSV遺傳變異研究提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 病料 2011年1月采自黃三角區(qū)某規(guī)模豬場患高熱癥仔豬的新鮮淋巴結、肝、肺、脾等組織樣品。

1．1．2 試劑 Trizol試劑盒為Invitrogen公司產品；AMV、RNase－inhibitor、rTaq酶、d NTPs、DNA標準DL 2 000等均為寶生物工程（大連）有限公司產品；DMEM培養(yǎng)基等細胞培養(yǎng)試劑為北京清大天一有限公司產品。

1．1．3 細胞 Marc－145細胞由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院惠贈。

1．2 方法

1．2．1 病料處理 疑似PRRSV病豬組織，經剪碎、研磨，加入DMEM培養(yǎng)液配成1∶5的病料懸液，在－20℃反復凍融3次后，4 000 r／min離心10 min，取上清液，經0．22μm濾器濾過除菌后加入青霉素﹑鏈霉素（1 000 U／m L），4℃過夜后置－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 病毒分離培養(yǎng) 將已經處理后的病料組織濾液接種于生長良好的Marc－145細胞單層，37℃吸附1 h，添加9 m L的細胞維持液（含20 m L／L小牛血清）后，在體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4 d～7 d，逐日觀察記錄細胞病變（CPE）。無病變繼續(xù)傳代，有病變的細胞液凍融3次后于－20℃存放備用。

1．2．3 病毒TCID50的測定 將第2代分離毒按照10－1、10－2、…10－6進行稀釋后，分別接種于長滿Marc－145細胞單層的96孔細胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度重復8個孔，每孔接種100μL病毒液，同時設陰性對照。將培養(yǎng)板置于37℃、在體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d～7 d，觀察細胞病變，按Reed－Muench法計算病毒的TCID50。

1．2．4 分離株的 RT－PCR檢測

1．2．4．1 引物設計 根據(jù)GenBank登錄的HB0706（FJ800681）株設計擴增分離株Nsp2部分序列的特異性引物，序列如下：上游引物F1：5′TTCAACCTCGAAGAACAAAGTC 3′；下游引物 F2：5′GCATGTCAACCCTATCCCAC 3′。擴增區(qū)間為2 671 bp～3 354 bp，目的片段預期大小為678 bp。

1．2．4．2 分離株總RNA的提取 采用RNA提取試劑盒進行RNA提取。

1．2．4．3 反轉錄體系（cDNA 的合成） 反轉錄酶0．5μL，5×buffer 4μL，d NTP 2μL，下游引物1 μL，模板3μL，DEPC處理超純水9．5μL。42℃反應1 h，70℃10 min。

1．2．4．4 PCR反應體系 cDNA 模板2μL，上下游引物各0．5μL，PCR buffer 2．5μL，d NTP 2μL，r Tag酶0．5μL，加水至25μL。反應參數(shù)為：94℃5 min；94℃45 s，56℃45 s，72℃60 s，32個循環(huán)；72℃10 min，4℃結束反應。結束后將PCR產物經10 g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1．2．5 外源病毒排除試驗 參考GenBank登錄的基因序列合成3對引物，采用PCR或RT－PCR檢測豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒。

1．2．6 人工感染試驗 選取4周齡～5周齡PRRSV抗體陰性（用ELISA抗體檢測試劑盒檢測）的健康仔豬10頭，攻毒組和對照組各5頭，攻毒組每頭豬滴鼻接種1 m L細胞分離毒（TCID50為10－4．625／m L），對照組滴鼻接種等量的 Marc－145細胞液。攻毒后隔離飼養(yǎng)，觀察14 d，每天測量體溫，觀察試驗豬精神和食欲。攻毒后對死亡豬剖檢，采取肺、脾、腎和淋巴結等病料，用RT－PCR檢測淋巴結和肺組織中的PRRSV，于攻毒后14 d將活豬全部處死，取肺、脾、腎和淋巴結等病料，用RT－PCR檢測淋巴結和肺組織中的PRRSV。

1．2．7 分離株ORF4、ORF5基因的擴增與克隆測序 參考文獻［4－5］設計引物，按建立的RT－PCR方法擴增ORF4、ORF5基因，用小量膠回收試劑盒純化PCR產物，然后將其插入到p MD18－T載體多克隆位點后，構建重組質粒，篩選出陽性重組質粒交上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1．2．8 HSJ－1102株 ORF4、ORF5基因序列分析

應用DNA Star 5．0軟件，將獲得的HSJ－1102株基因序列與 GenBank中登錄的 VR2332、JXA1、Ch1－a株等PRRSV代表毒株，以及國內多地區(qū)分離毒株的ORF4、ORF5基因序列進行比對，進行相似性分析，并構建遺傳進化樹。

2 結果

2．1 病毒分離

疑似PRRSV病料組織無菌處理后接種于Marc－145細胞單層，37℃ 培養(yǎng)7 d，傳2代以后，即出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為細胞圓縮、聚堆、脫落，形成病變灶，對照細胞無明顯變化。

2．2 分離株TCID50的測定

按Reed－Muench法計算分離病毒的TCID50為10－4．625／m L。

2．3 分離株的RT－PCR鑒定結果

對Marc－145細胞分離培養(yǎng)物進行總RNA的提取，并利用特異引物進行RT－PCR擴增，產物經10 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果擴增出678 bp的特異性條帶，與預期的擴增產物大小相符，對照為陰性（圖1）。

圖1 RT－PCR檢測分離病毒結果Fig．1 RT－PCR amplification of PRRSV

2．4 外源病毒排除試驗

經過PCR、RT－PCR檢測及細胞培養(yǎng)觀察，該分離株不含有偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒。

2．5 人工感染試驗

對照組的5頭仔豬精神狀態(tài)、飲食、運動、體溫情況均無明顯異常，而接種感染組5頭仔豬均出現(xiàn)了不同程度呼吸系統(tǒng)癥狀，被毛粗亂、飲食減少、精神不良或沉郁，咳嗽、打噴嚏，體溫升高1℃～3℃，3頭仔豬出現(xiàn)耳根發(fā)紫，腹部發(fā)紺等現(xiàn)象，并與接種后14 d前死亡。剖檢出現(xiàn)明顯的間質性肺炎表現(xiàn)，采集肺、脾、腎和淋巴結等病料進行PCR檢驗，均能檢測到PRRSV核酸片段。

2．6 分離株ORF4基因的擴增與序列分析

通過RT－PCR擴增ORF4基因片段，成功連接轉化p MD18－T載體并測序，應用DNA Star 5．0軟件對分離株的測序結果進行序列分析，并與Gen Bank上基因1型經典株VR2332株、基因2型LV株、CH1－a株，JXA1株，以及廣東、黑龍江、福建、河北、北京等地的分離株ORF4序列進行核苷酸同相似分析并繪制系統(tǒng)進化樹，分析結果表明，本毒株ORF4 基因與 HQ843180、GQ241731（山西）、EF112447（河北）、GQ359108（山東）、JXA1株等高致病性毒株遺傳距離最近，與VR2332等毒株親緣關系相對較遠。核苷酸相似性分析結果表明，該分離株ORF4基因序列與JXA1，Ch1－a等毒株的相似性較高，在97．4%～99．3%之間，與VR2332等毒株相似性低于90%（圖2）。

圖2 PRRSV HSJ－1102株的ORF4基因系統(tǒng)進化樹分析Fig．2 System development tree based on ORF4 gene sequence of HSJ－1102

2．7 分離株ORF5基因的擴增與序列分析

RT－PCR擴增 ORF5基因片段，連接轉化p MD18－T載體并測序，應用DNA Star5．0軟件對測序結果進行序列分析，并與GenBank上VR2332、LV、CH1－a、JXA1等代表毒株，以及廣東、黑龍江、福建、河南、北京等地的分離株ORF5序列進行核苷酸相似性分析并繪制系統(tǒng)進化樹，相似結果可見，分離株 HSJ－1102與基因1型相似性較高，在86．4%至97．8%，與基因2型相似性較低，為54．4%，分離株 HSJ－1102 與 CH1－a株相似性 為92．5%，與經典株 VR2332的相似性較差，為86．4%，與JXA1及廣東、江蘇等地區(qū)分離株相似性較高，為97%～99．8%。進化樹分析可見分離株HSJ－1102屬于基因1型毒株，與河南株處于同一個分支（圖3）。

圖3 PRRSV HSJ－1102株的ORF5基因系統(tǒng)進化發(fā)生樹分析Fig．3 Phylogenetic tree based on ORF5 gene sequence of HSJ－1102

3 討論

由于不同PRRSV分離株核苷酸序列存在廣泛而明顯的變異，給PRRS的準確檢測和有效控制帶來困難。特別是自2006年發(fā)生的以高熱、高發(fā)病率和高病死率為特征的傳染病以后，人們對PRRS投入了更多的關注。本研究采集黃河三角洲地區(qū)PRRS疑似病料，通過接種敏感細胞進行PRRSV分離鑒定，成功獲得一株PRRSV，在 Marc－145細胞上增殖良好，能夠產生明顯細胞病變。通過PCR鑒定有效地排除其他病毒的存在，人工感染試驗較好地復制出臨床發(fā)病模型，從而證明該分離株是一株高致病性PRRSV。

在對PRRSV主要蛋白結構與功能研究中，人們對ORF4、ORF5基因編碼的糖基化囊膜蛋白GP4、GP5的研究十分關注［6－7］。研究表明，GP4蛋白是一種典型的1型膜蛋白結構，包含有4個糖基化位點，C末端功能區(qū)具有糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定作用［8］。GP4糖蛋白的158至162位殘基與病毒復制有關，而M162殘基對于病毒感染尤為重要，GP4糖蛋白能夠與細胞表面受體CD163分子在細胞膜上發(fā)揮共同作用，從而介導病毒進入細胞［9］。多項研究均報道GP4蛋白中存在PRRSV中和抗原表位，但是針對GP4的單克隆抗體的中和活性遠遠不如GP5單克隆抗體［10］。GP5蛋白是病毒粒子表面含量最多的糖蛋白，因此稱作主要囊膜糖蛋白，GP5蛋白是受體表位識別蛋白，是能夠誘導中和抗體的主要蛋白［11］。GP5蛋白和病毒膜蛋白M蛋白由二硫鍵相連，在病毒粒子表面形成二聚體結構，作為病毒囊膜蛋白的主要蛋白結構［12］，與GP4一起，在病毒的吸附、病毒復制、病毒裝配、病毒變異和保護性反應等方面發(fā)揮著重要作用。因此本研究通過基因克隆與測序分析，獲得了HSJ－1102分離株的ORF4和ORF5基因序列，并與國內外流行株、經典株進行了比較分析［13－14］。通過分析發(fā)現(xiàn)，本毒株ORF4 基 因 與 HQ843180、GQ241731（山 西）、EF112447（河北）、GQ359108（山東）、JXA1株等高致病性毒株遺傳距離最近，尤其與GQ359108（山東）的核苷酸相似性為99．6%；本毒株ORF5基因與JXA1及廣東、江蘇等地區(qū)分離株相似性較高，均為97%以上，與EU200954株相似性達99．2%，因此判斷HSJ－1102分離株可能是黃河三角洲地區(qū)的流行株。

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Isolation，Identification and Genetic Analysis of ORF4，ORF5 Genes of PRRSV in Huanghe Delta Area

WU Yi－chun
（BiologyEngineeringDepartment，BinzhouVocationalCollege，Binzhou，Shandong，256603，China）

One porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）strain was isolated from a sick piglet in Huanghe delta area by inoculating it into Marc－145 cells．The isolated strain can induce Marc－145 cell cytopathic effect，with TCID5010－4．625／m L．PCR based on PRRSV NSP2 gene，pseudorabies virus，classical swine fever virus，porcine circovirus showed PRRSV positive and other viruses negative．Piglets artificial infected with the second passage cell cultures showed high fever，cough，cyanosis，blue ears，and even death．Obvious interstitial pneumonia can be found during postmortem inspection．Thus the isolated virus was confirmed as a highly pathogenic strain which named HSJ－1102 strain．Genetic analysis of ORF4 showed the strain was in a branch with JXA1，Ch1－a strains，with the identity 97．4%to 99．3%．The strain was in a different branch with VR－2332 strain，the identity was lower than 90．0%．Genetic analysis of ORF5 showed the strain was in a branch with JXA1 strain，with identity 97．0%to 99．8%．The strain was in a different branch with Ch1－a and VR－2332 strains，the identity was lower than 92．5%．

PRRSV；isolation and identification；ORF4；ORF5

S852．659．6

A

1007－5038（2012）06－0037－04

2012－04－01

濱州職業(yè)學院科研項目（10xykt06）

吳憶春（1976－），女，安徽安慶人，講師，碩士研究生，主要從事微生物學研究。