廣東省寵物源偽中間型葡萄球菌的耐藥性調查研究

馮言言，田 偉，羅倩怡，周穎澤，曾振靈，陳杖榴，劉健華

（華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州510642）

廣東省寵物源偽中間型葡萄球菌的耐藥性調查研究

馮言言，田 偉，羅倩怡，周穎澤，曾振靈，陳杖榴，劉健華＊

（華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州510642）

為調查廣東省寵物源偽中間型葡萄球菌（Staphylococcuspseudintermedius）的攜帶和耐藥情況，從小動物臨床采集皮膚、耳部和鼻腔等部位的樣品，分離鑒定偽中間型葡萄球菌，并采用瓊脂稀釋法和紙片擴散法對偽中間型葡萄球菌進行抗菌藥物敏感性檢測，采用PCR方法檢測mec A基因。結果表明，從898個樣品中共分離到144株偽中間型葡萄球菌，檢出率為16．0%，皮膚、耳部和鼻腔的偽中間型葡萄球菌檢出率分別為20%（64／319）、17．8%（64／359）和7．5%（3／40）。抗菌藥物敏感性檢測和 mec A 基因檢測結果顯示有89株（61．8%）為耐甲氧西林偽中間型葡萄球菌（MRSP）。偽中間型葡萄球菌對氨芐西林、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素和四環(huán)素的耐藥率均在80%以上，對利福平和阿米卡星的耐藥率低于8%，對萬古霉素、利奈唑胺、喹奴普汀／達福普汀和替考拉寧均敏感。大部分（＞69%）MRSP對紅霉素、克林霉素、泰樂菌素、阿奇霉素、復方新諾明、四環(huán)素、環(huán)丙沙星和恩諾沙星等抗菌藥物表現(xiàn)耐藥。本研究結果表明寵物源偽中間型葡萄球菌的耐藥情況嚴重且MRSP的檢出率高，應高度重視寵物源細菌耐藥問題。

耐甲氧西林偽中間型葡萄球菌；耐藥；偽中間型葡萄球菌；寵物

偽中間型葡萄球菌（Staphylococcuspseudintermedius，SP）是由 Devriese L A 等［1］發(fā)現(xiàn)并命名的一種新的凝固酶陽性葡萄球菌，能夠引起犬、貓等動物感染和發(fā)病，如犬膿皮病、外耳道炎、傷口感染、尿道感染以及其他一些感染。近來來有人感染動物源偽中間型葡萄球菌的病例報道［2－3］，表明偽中間型葡萄球菌是一種重要的動物傳染性病原菌，并可能對公共健康造成一定威脅。

近年來，寵物源耐甲氧西林偽中間型葡萄球菌（MRSP）菌株的數量急劇增加，更為嚴重的是，MRSP對獸醫(yī)臨床上使用的多種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥，逐漸成為累積多種不同抗菌藥物耐藥基因的“蓄水池”［4］。目前，國內已有關于豬源或寵物源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的耐藥性調查［5－6］，但還少見有寵物源 MRSP藥物敏感性的研究［7］。本研究擬調查廣東省寵物源偽中間葡萄球菌的攜帶率和藥物敏感性，了解國內華南地區(qū)MRSP的發(fā)生情況，為指導小動物臨床合理用藥提供依據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株來源 2007年11月至2009年10月，從廣東省10家寵物醫(yī)院采集健康或患病犬貓的耳部、皮膚、傷口、鼻腔、眼角、肛門、外陰以及泌尿道等樣品。質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213和ATCC25923均購自中國藥品與生物制品檢定所。

1．1．2 藥品、培養(yǎng)基以及儀器 青霉素G、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢唑啉、硫酸慶大霉素、硫酸阿米卡星、鹽酸環(huán)丙沙星、氯霉素均為中國藥品與生物制品檢定所產品；恩諾沙星、四環(huán)素、氟苯尼考、紅霉素、阿奇霉素、泰樂菌素、克林霉素、利福平、替米考星均為廣州威佳生物有限公司產品；苯唑西林鈉、泰妙菌素、沃尼妙林、萬古霉素為廣州翔博生物科技公司產品；復方新諾明（1．25／23．75μg）、利奈唑胺（30μg）、替考拉寧（30μg）、喹奴普?。_福普?。?5μg）紙片均為英國Oxoid公司產品；MH瓊脂、甘露醇高鹽瓊脂、BP瓊脂、NaCl高鹽肉湯、亞碲酸卵黃增菌液、過氧化氫、兔血漿均為青島海博生物有限公司產品；溶葡萄球菌素為美國Sigma公司產品；蛋白酶K、Taq酶等均為寶生物工程（大連）有限公司產品；PCR儀為美國Eppendorf公司產品；電泳凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio－Rad公司產品。

1．2 方法

1．2．1 細菌的分離鑒定 將采集的樣品接種于75g／L NaCl高鹽肉湯中于37℃恒溫培養(yǎng)24 h～48 h，然后用接種環(huán)蘸取菌液劃線于配置好的甘露醇高鹽瓊脂，37℃培養(yǎng)后，挑取疑似單菌落劃線于含亞碲酸卵黃增菌液的BP平板上，37℃培養(yǎng)24 h～48 h后，挑取BP平板上帶有黑色透明環(huán)的可疑菌落進行純培養(yǎng)，然后進行革蘭染色鏡檢、觸酶試驗和血漿凝固酶試驗，篩選出疑似偽中間型葡萄球菌。

按照Vanderhaeghen W等［8］報道，制備細菌基因組DNA，貯存于－20℃?zhèn)溆?。根據Bannoehr J等［9］報道的16 S rRNA基因和hsp60基因的引物合成和擴增條件，進行PCR擴增確定偽中間型葡萄球菌。

1．2．2 MRSP的確定 按照Jonas D 等［10］報道合成特異性引物擴增mec A基因（310 bp），并將陽性產物測序，ATCC29213作為陰性對照。按照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）推薦的操作程序［11］，采用瓊脂稀釋法檢測偽中間型葡萄球菌對苯唑西林的敏感性。根據CLSI的判斷標準，苯唑西林MIC≥4 mg／L或檢測出mec A基因的菌株確定為MRSP。1．2．3 藥敏試驗 除復方新諾明、利奈唑胺、喹奴普?。_福普汀和替考拉寧采用紙片擴散法檢測藥物敏感性外，其余抗菌藥物均采用瓊脂稀釋法，兩種方法均按照CLSI推薦的操作程序進行［11］，質控菌株分別為ATCC25923和ATCC29213。藥物敏感性結果判斷按照CLSI標準進行［11］。

2 結果

2．1 偽中間型葡萄球菌的分離鑒定

共采集898個樣品，樣品經選擇性培養(yǎng)，篩選出葡萄串狀、觸酶試驗陽性和血漿凝固酶陽性的疑似偽中間型葡萄球菌，經16 S r RNA、hsp60基因擴增測序確定后，共獲得144株偽中間型葡萄球菌，分離率為16．0%（144／898），其中在寵物犬和貓的分離率分別為19．6%（123／629）和7．8%（21／269）。樣品數較多的皮膚、耳部和肛門的偽中間型葡萄球菌檢出率分別為20%（64／319）、17．8%（64／359）和1．5%（2／132），其他部位的分離率分別為鼻腔7．5%（3／64）、嘴部21．1%（4／19）、傷口6．67%（1／15）、眼部42．9%（3／7）、尿道20%（1／5）和外陰100%（2／2）。含 mec A基因（圖1）且苯唑西林MIC≥4μg／m L的偽中間型葡萄球菌有55株，mecA陽性但苯唑西林敏感的菌株有14株，20株菌mec A基因陰性但對苯唑西林耐藥。因此，根據CLSI對MRSP的判斷標準共檢測到89株（61．8%）MRSP。患病寵物 MRSP攜帶率（54／88，61．4%）比健康寵物 MRSP攜帶率（35／62，56．5%）稍高，無顯著差異（P＞0．05）。偽中間型葡萄球菌的分離率見表1。

表1 偽中間型葡萄球菌和耐甲氧西林偽中間型葡萄球菌的來源Table 1 Origins of S．pseudintermedius and MRSP

2．2 藥物敏感性試驗

偽中間型葡萄球菌對氨芐西林、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素和四環(huán)素的耐藥率均在80%以上，對利福平和阿米卡星的耐藥率低于8%，對萬古霉素、利奈唑胺、喹奴普汀－達福普汀和替考拉寧均敏感。大部分（＞69%）MRSP對紅霉素、泰樂菌素、克林霉素、阿奇霉素、復方新諾明、四環(huán)素、環(huán)丙沙星和恩諾沙星等抗菌藥物表現(xiàn)耐藥，且對青霉素、克林霉素、紅霉素、復方新諾明和環(huán)丙沙星呈現(xiàn)多重耐藥。MRSP對慶大霉素、替米考星、氟苯尼考和泰妙菌素呈現(xiàn)一般耐藥，耐藥率分別為25．8%、50．6%、18．0%和14．6%。除氯霉素和氟苯尼考外，MRSP對抗菌藥物的耐藥率均高于甲氧西林敏感的偽中間型葡萄球菌（MSSP）。

3 討論

在當今社會，隨著人們生活質量的提高，寵物的飼養(yǎng)率在不斷提高，人類與寵物的親密接觸越來越頻繁，這就使得動物源病原菌在動物與人類之間傳播，導致嚴重的公共衛(wèi)生問題。偽中間型葡萄球菌是重要的動物源病原菌之一，耐甲氧西林偽中間型葡萄球菌（MRSP）的多重耐藥也為臨床合理用藥和治療帶來了極大困難。因此，MRSP引起了國內外的廣泛關注。

圖1 mec A基因電泳圖Fig．1 Electrophoresis of mec A gene

表2 偽中間型葡萄球菌的藥物敏感性Table 2 The susceptibilities of antimicrobial agents against S．pseudintermedius isolates

本研究中，偽中間型葡萄球菌的分離率為16．0%（144／898），寵物犬分離率19．6%，高于貓的分離率7．8%，可以看出偽中間型葡萄球菌的宿主主要為寵物犬，這與國外的報道是一致的［12］。偽中間型葡萄球菌在皮膚、耳部和肛門的分離率分別為20%（64／319）、17．8%（64／359）和1．5%（2／132），即在皮膚、耳部的分離率較高，但是在肛門的分離率較低，這與國外的報道［13］略有差異。

由于抗生素的廣泛使用，寵物MRSP的分離率增大［14］。本研究中 MRSP的分離率為9．91%（89／898），高于國外的報道［15］，可能與國內小動臨床抗菌藥物的大量使用有關［16］。藥敏試驗結果表明，偽中間型葡萄球菌對氨芐西林、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素和四環(huán)素的耐藥率均在80%以上，對利福平和阿米卡星的耐藥率均低于8%。MRSP對青霉素、氨芐西林、紅霉素、克林霉素、泰樂菌素、阿奇霉素、復方新諾明和四環(huán)素的耐藥率均在80%以上，且呈現(xiàn)多重耐藥，這與國外的報道是一致的［17－18］。幸運的是，本研究中未發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素、利奈唑胺、替考拉寧和喹奴普汀／達福普汀的MRSP。本研究中宿主寵物（犬和貓）在臨床治療中大多使用過廣譜抗菌藥物，因此在抗生素選擇壓力下更容易造成菌株耐藥。可以推測，寵物臨床治療中大量抗生素的不規(guī)則使用增加了抗生素的選擇壓力，從而使寵物源細菌耐藥情況更加嚴重。

據我們所知，本文首次報道了廣東地區(qū)寵物源偽中間型葡萄球菌的耐藥情況，可以看出寵物的耐藥問題嚴重，應加強對寵物源細菌耐藥性的監(jiān)測以及對寵物臨床用藥的指導和監(jiān)管，避免寵物源耐藥菌向人類的傳播。

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Antimicrobial Resistance ofStaphylococcuspseudintermediusIsolated from Pets in Guangdong Province

FENG Yan－yan，TIAN Wei，LUO Qian－yi，ZHOU Ying－ze，ZENG Zhen－ling，
CHEN Zhang－liu，LIU Jian－h(huán)ua
（CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou，Guangdong，510642，China）

The purpose of this study was to investigate the carriage rate and antimicrobial resistance ofStaphylococcuspseudintermedius（SP）isolated from pets in Guangdong province．S．pseudintermediuswere isolated from samples collected from skin，ear，nasal cavity and other parts of pets．The antimicrobial susceptibility test was carried out by agar dilution method and disk diffusion method．PCR was carried out to detectmec Agene．A total of 144（16．0%）S．pseudintermediusstrains were obtained from the 898 samples collected from pets．The detection rates of skin，ear and nasal cavity were 20% （64／319），17．8%（64／359）and 7．5% （3／40），respectively．The antimicrobial susceptibility test results andmec Adetection result showed that 89（61．8%）were methicillin－resistantS．pseudintermedius（MRSP）．Resistance rates of the 144S．pseudintermediusto ampicillin，erythromycin，azithromycin，clindamycin and tetracycline were over 80%．Resistance rates to amikacin and rifampicin was under 8%．All of the 144S．pseudintermediuswere susceptible to vancomycin，linezolid，quinupristin／dalfopristin and teicoplanin．Most（more than 69%）MRSP resisted to erythromycin，clindamycin，tylosin，azithromycin，trimethoprim－sulfamethoxazole，tetracycline，ciprofloxacin，and enrofloxacin．In conclusion，the high level antimicrobial resistance and high detection rate of MRSP was observed among theS．pseudintermediusisolates from companion animals．More attention should be addressed to the serious bacterial resistance in companion animals．

MRSP；antimicrobial resistance；Staphylococcuspseudintermedius

S852．611

A

1007－5038（2012）06－0006－05

2012－02－20

高等學校博士學科點專項科研基金項目（20104404110008）

馮言言（1986－），女，山東棗莊人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)藥理與毒理學研究。＊通訊作者