Fcα受體在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人成纖維樣滑膜細胞的表達與功能研究

喻 晶 聶李平 顏存糧 劉小平 桂耀庭

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性全身性自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機制目前尚未完全明了。至今，RA尚無特效治療方法，一旦發(fā)病，不易治愈，常常終身罹患，因此進一步深入探討RA的發(fā)病機制對于其治療具有重要意義。

IgA型類風(fēng)濕因子(IgA－RF)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中具有重要的臨床意義。研究表明，以IgA－RF增高為主的RA患者其病變程度更嚴重，對抗TNF－α生物制劑的療效差［1，2］。在RA的早期檢測出IgA－RF升高預(yù)示著病程進展更快，預(yù)后較差［3］。目前還不清楚為什么IgA－RF與疾病的嚴重性相關(guān)。存在于關(guān)節(jié)滑液的IgA－RF，如何作用于關(guān)節(jié)滑膜的成纖維樣滑膜細胞(FLS)，作用后是否會產(chǎn)生生物效應(yīng)?對RA起促進作用還是抑制作用?FLS上是否存在IgA的受體?目前尚未見報道。本研究從基因和蛋白水平探討 IgA受體，即 Fcα受體(FcαR，CD89)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人成纖維樣滑膜細胞(RA FLS)的表達，并對其功能進行研究，以闡明IgA及其受體在RA發(fā)生中的作用，為探討RA的發(fā)病機制及治療措施提供新的思路。

材料與方法

1.主要材料與試劑:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人成纖維樣滑膜細胞(RA FLS)購自美國cell applications公司(San Diego，CA，USA)，U937(人髓系白血病細胞株)購自美國ATCC，DMEM及RPMI1640細胞培養(yǎng)液，TRIzol、反轉(zhuǎn)錄酶MMLV、oligo dT、dNTPs、RNasin、Taq DNA酶為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，分泌型IgA(sIgA)和TNF－α購自美國Sigma公司，單聚體IgA (m IgA)及人IL－6 ELISA試劑盒為美國Piece公司產(chǎn)品。

2.細胞培養(yǎng):類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人成纖維樣滑膜細胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清(FBS)、105U/L青霉素及105U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中。每3天換液1次，細胞達到融合后傳代培養(yǎng)，3～7代的細胞用于實驗。U937細胞株用含10% 的胎牛血清、105U/L青霉素及105U/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，作為Fcα受體的陽性對照。

3.免疫熒光染色:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人成纖維樣滑膜細胞生長于用膠原(0.2mg/ml)處理過的載玻片上，達到80%的細胞融合后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，4%多聚甲醛4℃固定細胞20min，PBS洗3次，用含5%馬血清、0.2%Triton X－100的PBS于37℃孵育60min，以阻斷非特異性反應(yīng)。加1∶25 Fcα受體的單克隆抗體(BD Pharmingen，USA)37℃孵育60min，PBS洗3次，加FITC標(biāo)記的驢抗鼠IgG(Jackson Laboratories，USA)，37℃孵育30min，PBS洗3次，用緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

4.反轉(zhuǎn)錄－多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR):采用TRIzol RNA提取液提取類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人成纖維樣滑膜細胞和U937的總RNA。取總RNA 3μg，加入oligo dT 1μl，(500μg/ m l)、10mmol/L dNTPs 1μl，加 DEPC處理水至12μl，置于65℃孵育5min，迅速置冰上，加入5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl、RNasin 1μl、M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶1μl(200U/μl)，加水至20μl，37℃孵育50min，70℃15min，得到反轉(zhuǎn)錄模板cDNA。

按照Genebank的Fcα受體基因序列，選擇Fcα受體的IgA結(jié)合序列區(qū)段，設(shè)計引物。上游為:5'CCT CAG TCTGGG GCT TTC TTT 3'，下游引物為:5'CTTGTT TGCGTCCATGTG GTC 3'，擴增產(chǎn)物大小241bp。引物由中國上海生物工程公司合成。取反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物cDNA 5μl，加入10×PCR緩沖液5μl、10mmol/L dNTPs 1μl、PCR特異性引物(50μmol/L)各0.5μl、Taq DNA聚合酶0.4μl(5U/μl)，加水至50μl。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3min;94℃變性45s、55℃退火30s、72℃延伸90s，共30個循環(huán);72℃延伸10min。1.5%瓊脂糖凝膠分離 RT－PCR產(chǎn)物，凝膠成像分析儀(Dolphin DOC，Wealtec，USA)處理圖像。

5.RA FLS細胞上清液中IL－6含量測定:細胞培養(yǎng)至80%融合，改用不含胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，加入m IgA(10μg/ ml)，sIgA(10μg/m l)，TNF－α(10ng/ml)，培養(yǎng)12h后，取細胞培養(yǎng)上清液，13000r/min離心10min，留上清于－80℃ 保存?zhèn)溆?。按照試劑說明書檢測細胞上清液中IL－6的含量。

6.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.IgA受體在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人成纖維樣滑膜細胞(RA FLS)的表達:(1)RT－PCR結(jié)果:用RTPCR的方法在基因水平檢測Fcα受體mRNA在RA FLS上的表達，結(jié)果顯示陽性對照細胞U937及RA FLS的RT－PCR產(chǎn)物在241bp處均可見明顯的條帶(圖1)，表明Fcα受體在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人成纖維樣滑膜細胞上有表達。(2)免疫熒光染色結(jié)果:用Fcα受體的單克隆抗體對RA FLS進行免疫熒光染色，在蛋白水平檢測Fcα受體在RA FLS的表達，結(jié)果顯示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人成纖維樣滑膜細胞上存在Fcα受體(圖2)。

2.IgA對RA FLS分泌IL－6水平的影響:對照、m IgA、sIgA、TNF－α、sIgA+TNF－α、m IgA+TNF－α組的IL－6含量分別為153.12±41.98、206.27± 46.06、600.02±42.36、880.02±26.06、1290.02± 134.56、878.12±62.82pg/ml。sIgA(10μg/m l)與RA FLS孵育12h后，細胞上清液中的IL－6水平明顯高于空白對照組，差異具有顯著性(t=18.82，P＜0.01)。m IgA(10μg/ml)與RA FLS孵育12h后，細胞上清液中的IL－6的含量與空白對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(t=2.59，P＞0.05)。TNF－α(10ng/ml)能明顯增加IL－6含量(t=34.33，P＜0.01)。sIgA (10μg/ml)+TNF－α(10ng/ml)同時與RA FLS孵育12h后，其上清液中的IL－6含量明顯高于sIgA或TNF－α單一組(t分別為9.08和6.16，P＜0.01)。

討論

Fcα受體屬于免疫球蛋白超家族，主要表達于中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、庫普弗細胞、樹狀突細胞，其是否在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人成纖維樣滑膜細胞表達，目前國內(nèi)外尚未見報道。本研究采用RT－PCR及免疫熒光技術(shù)，從基因和蛋白水平均檢測到Fcα受體在RA FLS的表達，表明RA FLS存在Fcα受體。

RA FLS位于關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)層，占關(guān)節(jié)滑膜細胞的70%～80%。目前已經(jīng)確定RA FLS是介導(dǎo)RA關(guān)節(jié)破壞病理過程的主要細胞［4］。TNF－α和IL－6在RA發(fā)病中起著極其關(guān)鍵作用，TNF－α可刺激RA FLS增生活化，增加IL－6分泌，IL－6促進破骨細胞的聚集，對骨組織造成侵蝕破壞［4～6］。IL－6分泌水平與RA疾病的嚴重性和活動性密切相關(guān)，采用IL－6的抑制劑可明顯改善RA患者的癥狀［6，7］。本研究發(fā)現(xiàn)Fcα受體存在于RA FLS，IgA與其結(jié)合后是否會產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)?實驗結(jié)果顯示，sIgA作用于RA FLS后，明顯增高細胞分泌IL－6水平(P＜0.01)。sIgA與TNF－α同時作用于RA FLS后，IL－6的分泌量明顯高于sIgA或TNF－α的單一作用，說明兩者相加可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，促使IL－6分泌增加。m IgA使RA FLS分泌IL－6的量高于對照組，但其差異無顯著性，與TNF－α合用對IL－6的生成無協(xié)同作用。SIgA使IL－6增高的原因可能是因為sIgA呈二聚體形式，其比單聚體IgA(m IgA)對Fcα受體有更強的結(jié)合能力和作用效果。而存在于關(guān)節(jié)滑膜液中的IgA－RF，主要以多聚體形式存在。

雖然目前類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病因和發(fā)病機制尚未完全明了，但大量研究表明細胞因子在RA關(guān)節(jié)滑膜病變中起了核心作用，以細胞因子為靶位的生物制劑已應(yīng)于臨床治療［4，7］。新型的IL－6拮抗劑Tocilizumab能明顯改善RA癥狀、關(guān)節(jié)損傷和全身表現(xiàn)，對傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥(DMARD)或TNF－α抑制劑療效不佳的患者，可改善癥狀，說明IL－6在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中起了重要的病理作用。從本實驗的研究結(jié)果推測以IgA－RF增高為主的RA患者其病變程度更嚴重，對抗TNF－α生物制劑的療效差，可能與患者的RA FLS分泌IL－6水平明顯增高有關(guān)，采用抗IL－6的生物制劑可能使患者受益。

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