rhBMP－2對兔下頜骨放療后骨延長的影響

麻益可 沈國芳 王麗珍

自Urist首先發(fā)現(xiàn)了BMP，以后的研究發(fā)現(xiàn)BMP具有促進成骨作用。在BMP家族中，BMP－2、BMP－4、BMP－7的成骨能力最強。rhBMP－2已經(jīng)被證實在骨愈合中有促進成骨作用［1，2］。Wurzler等［3］發(fā)現(xiàn)rhBMP－2可以促進大鼠放射后顱骨缺損的修復(fù)，盡管修復(fù)的骨量仍然低于為放射組。目前，尚無rh-BMP－2作用于放射后頜骨骨延長的研究和報道。通過先期的研究表明，放射后兔下頜骨骨延長的新生骨形成受到了抑制。本研究的目的就在于在截骨間隙置入rhBMP－2以觀察其能否促進新生骨的形成。

材料與方法

1.材料:本研究置入材料核心成分是rhBMP－2，載體材料是藥用明膠、大豆卵磷脂及羥基磷灰石，由杭州華東基因技術(shù)研究所贊助提供。牽引器由浙江慈北醫(yī)療器械公司提供，依據(jù)兔下頜骨定制的手控式內(nèi)置式牽引器，由牽引桿、牽引體和固定腳組成，牽引螺距為0.40mm/360°，最長牽引長度為15.0mm。

2.實驗動物入選標(biāo)準(zhǔn)及分組:雄性新西蘭大白兔，約6月齡，體重2.0～3.0kg，共12只兔。兔入圈圈養(yǎng)1周，隨機化實驗分為兩組，每組各6只，具體如下:①對照組:術(shù)前接受50Gy放射劑量，間歇1個月后進行骨延長;②rhBMP－2組:與對照的差別僅在術(shù)中置入骨優(yōu)導(dǎo)，其他均一致。

3.放射處理:由上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科放療室提供專業(yè)放射人員和Theration 780－C型60Co遠(yuǎn)距離治療機(AECLmedical，加拿大)，照射方式是外照射。隨機確定實驗放射側(cè)，放射在全麻下進行。以第1前磨牙前緣中點為放射中心，照射野大小為3.0cm×3.0cm，源皮距為80cm，表面覆蓋一層等效物。放射方案為:每次5.6Gy，每天照射1次，連續(xù)照射5天(根據(jù)TDF表，上述放射方案相當(dāng)于常規(guī)放射的25次50Gy)。

4.手術(shù):術(shù)前無需禁食，肌內(nèi)注射速眠新Ⅱ液0.1ml/kg和氯氨酮0.1ml/kg，麻醉起效后，雙側(cè)頜下、面部和頸部備皮，剪除兔毛。側(cè)臥于手術(shù)臺，四肢固定，常規(guī)消毒鋪巾。手術(shù)部位加以0.5%利多卡因皮下局部注射，以加強麻醉效果。對照組:切口于放射側(cè)下頜下，切開皮膚及皮下組織，長約2.0cm，尋及面動靜脈予以結(jié)扎、剪斷，以減少出血。暴露下頜骨頰側(cè)，橫行切開骨膜并剝離骨膜，顯露下頜骨骨質(zhì)、頦孔和下牙槽神經(jīng)，剪斷下牙槽神經(jīng)，推開。剝離時保護頰側(cè)牙齦附著，避免與口腔相通。舌側(cè)骨膜不予剝離，以盡量保留下頜骨血供。截骨于第1前磨牙前和頦孔間。于下頜角切開長約3mm皮膚切口，牽引桿穿過皮下層和該切口，放置于其后方，預(yù)安置牽引器，各骨段2枚自鉆螺釘固定，拆除牽引器。以φ1mm小球鉆以2000r/min的速度逐層去除頰側(cè)骨皮質(zhì)、骨松質(zhì)，同時予無菌生理鹽水沖洗、冷卻;舌側(cè)骨皮質(zhì)以骨鑿輕輕鑿斷。伸入骨鑿于截骨線，以能完全撬動兩側(cè)骨段為截斷標(biāo)準(zhǔn)，原位復(fù)置牽引器。創(chuàng)口沖洗，充分止血，常規(guī)縫合關(guān)創(chuàng)。于對側(cè)相同位置以相同方法截斷下頜骨，不安置牽引器，逐層關(guān)創(chuàng)。術(shù)中根據(jù)需要，可適時追加麻醉藥物初次劑量的半量。rhBMP－2組與對照組的差別在于:試牽引成功后，復(fù)位;創(chuàng)口沖洗，充分止血后將rhBMP－2填入截骨間隙。待兔完全蘇醒，送回籠中，與精飼料為主，卷心菜為輔喂養(yǎng)。術(shù)后當(dāng)天開始肌內(nèi)注射30000U青霉素，每天2次，連續(xù)注射7天。

5.牽引方案:間歇8天后開始牽引，每天0.4mm，每天2次，連續(xù)牽引10天，固定期6周。

6.觀察和評價指標(biāo):(1)活體觀察:術(shù)后觀察兔的進食、創(chuàng)口愈合等情況。固定期6周結(jié)束時，處死后取得兩側(cè)下頜骨離體標(biāo)本。觀察新生骨的外形和質(zhì)地，測量新生骨的長度。(2)X線片評價:分別于牽引結(jié)束次日、固定期3周和固定期6周時在拍攝下頜骨橫斷咬合X線片以觀察牽引間隙是否有效形成、牽引間隙內(nèi)骨質(zhì)狀況等。(3)HE組織學(xué):離體標(biāo)本拍好X線后立即鋸取新生骨，以10%中性緩沖甲醛液固定，由上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科病理室完成脫鈣、脫水、石蠟包埋、切片和HE染色等，切片切面為下頜骨橫斷面。

隨機取每個標(biāo)本最中央且放大倍數(shù)為4×10的圖片4張，應(yīng)用Image－Pro Plus 4.5.1圖像分析軟件進行組織學(xué)半定量分析，分別測量新生骨骨小梁總面積和視野總面積，并計算骨小梁面積比，記平均值。計算公式:骨小梁面積比=骨小梁面積總面積/視野總面積。數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.活體觀察:所有動物都完成了實驗，有效形成牽引間隙并存活到固定期6周。牽引完成后，下頜明顯偏向?qū)?cè)，上下前牙均處于空咬狀態(tài)。上下前牙隨時間推移而伸長，并造成下頜口腔黏膜的創(chuàng)傷性潰瘍，但均不影響進食。

2.大體標(biāo)本觀察:實驗組和對照組的螺釘均與骨組織固定牢固。實驗側(cè)下頜骨新生骨均呈直線延長，延長長度6.7±1.1mm。所有舌側(cè)、上下端及頰側(cè)骨皮質(zhì)與周圍骨質(zhì)無明顯的界限，連續(xù)性完好，難以區(qū)分原有骨質(zhì)與新生骨的界限。頰舌側(cè)骨質(zhì)均致密，質(zhì)硬(圖1)。兩組在大體標(biāo)本上無明顯差別。對側(cè)的截骨部位也可見臨床正常愈合，未見骨段間的錯位愈合，難以分辨出截骨線。

3.X線檢查:牽引結(jié)束次日，均可見牽引間隙有效形成;牽引間隙內(nèi)為低密度軟組織透光區(qū)，截骨邊緣銳利清晰，無骨質(zhì)形成跡象。骨優(yōu)導(dǎo)透射X線，未能顯影。固定期3周時，均可見整個牽引間隙內(nèi)較均勻、密度略低于正常的阻射影，呈細(xì)條帶排列，方向與牽引力方向一致，截骨邊緣模糊不清，骨皮質(zhì)影隱約可見，但是未見典型的骨小梁結(jié)構(gòu)和中央?yún)^(qū)。rhBMP－2組牽引間隙內(nèi)，可以區(qū)分出骨皮質(zhì)。50Gy組未見明顯的骨皮質(zhì)高密度影。固定期6周時，牽引間隙內(nèi)充滿高密度影，密度與周圍骨質(zhì)相似，原截骨邊緣消失;可見骨小梁，均勻分布于新生骨內(nèi)，排列方向與牽引方向一致。頰舌側(cè)骨皮質(zhì)致密。分辨不出兩組間的差別(圖2)。

4.組織學(xué)觀察:HE染色兩組均可見形成新生骨組織，密質(zhì)骨和松質(zhì)骨均可見帶狀淺藍(lán)色類骨質(zhì)，骨小梁排列方向均與牽引方向相同。兩組的骨小梁均較稀疏、細(xì)小，分布較均勻;密質(zhì)骨和骨小梁內(nèi)含有豐富的骨細(xì)胞，骨細(xì)胞核呈圓形，骨陷窩周圍被環(huán)形類骨質(zhì)包繞;大部分骨小梁邊緣可見大量為柱狀或立方

圖2 X線圖

狀成行緊密排列的成骨細(xì)胞，排列整齊;未見哈佛氏系統(tǒng)和破骨細(xì)胞，骨髓均為脂肪性骨髓。兩組中均未見軟骨形成。所有12個標(biāo)本的骨小梁間都可以見到成片狀致密纖維結(jié)締組織(圖3)。

圖3 HE染色組織學(xué)表現(xiàn)

5.統(tǒng)計學(xué)結(jié)果:rhBMP－2組和50Gy組骨小梁面積比分別為0.459±0.036，0.445±0.054。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，P=0.61(＞0.05)，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

討論

BMP是一種疏水酸性糖蛋白，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)BMP－1～13，其中起重要作用是BMP－2、BMP－4、BMP－7。BMP能促進細(xì)胞的有絲分裂和轉(zhuǎn)化，能誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞，從而促進成骨［4～6］。研究還表明rhBMP－2具有強大的促進成骨作用，而且rhBMP－2誘導(dǎo)形成的新骨，經(jīng)組織學(xué)、生物力學(xué)和放射影像學(xué)證實，與正常骨質(zhì)無差別［7，8］。Wurzler等［3］研究發(fā)現(xiàn)rhBMP－2可以促進大鼠放射后顱骨缺損的修復(fù)，但是形成的新骨仍不如未放射者。在本研究中rhBMP－2組和50Gy組的新生骨頰舌側(cè)骨皮質(zhì)均致密、質(zhì)硬。在牽引結(jié)束后、固定期3周、6周的X線片，都顯示相似的成骨表現(xiàn)。組織學(xué)可見兩組的骨小梁密度均較稀疏、細(xì)小，骨小梁間存在致密纖維結(jié)締組織。這些均提示，rhBMP－2未能促進兔下頜骨放射后骨延長的新生骨形成。

研究表明，新生骨的形成量和骨密度與局部置入的rhBMP－2初始濃度和持續(xù)時間正相關(guān)。rhBMP－2單獨局部使用效果并不理想，主要原因是rhBMP－2作為多肽生長因子在局部很容易被稀釋、分解和吸收，不能長久有效的刺激靶細(xì)胞。因此，具有緩釋性能的rhBMP－2產(chǎn)品更有利于成骨［9］。本研究術(shù)中同期置入的核心和主要成分是二聚體rhBMP－2，純度在95%以上，且其中含有具有緩釋性能的少量卵磷脂作為載體，在2～3周內(nèi)緩慢完全釋放。

眾多研究表明rhBMP－2也可以在骨延長中可以促進成骨。諸多等研究表明rhBMP－2對骨延長有明顯的促進新生骨形成作用［10，11］。研究發(fā)現(xiàn)，rh-BMP－2最佳局部濃度與動物種屬級別正相關(guān);犬類下頜骨最佳濃度約為人類下頜骨1/2。由此可以推斷，兔下頜骨的用量應(yīng)該更少。根據(jù)本研究者測得，人體下頜骨體部的冠狀截面積約為2.7cm×1.2cm;兔本實驗的截骨部位處截面積約為1.0cm×0.6cm，為前者的1/5.4。以此可以推斷，兔局部下頜骨截骨處的rhBMP－2用量應(yīng)該少于人的1/10。本研究中骨延長的截骨間隙僅約2mm，而且兔下頜骨體部短小，僅能容納約2.0mg的rhBMP－2復(fù)合材料。該劑量約為廠商人體推薦用量的1/10，而且也有研究證實1.5mg的rhBMP－2完全能促進新骨形成［11］。因此，術(shù)中同期置入量是合理的。

Wurzler等［3］研究還發(fā)現(xiàn)在促進大鼠放射后顱骨缺損的修復(fù)時，rhBMP－2劑量高效果較劑量低者好。在本部分研究中，兩組的新生骨沒有明顯的差別。是2.0mg rhBMP－2不足以促進成骨?或者是rhBMP－2本身對放射后骨延長新生骨的形成沒有促進作用?這尚需要進一步的研究。

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