CD47在急性髓細(xì)胞白血病干細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床意義探討

李婉紅 陳葆國(guó) 鄭 瑞 李伯利

研究表明，白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells，LSCs)是白血病發(fā)生、發(fā)展的起始細(xì)胞，少量的LSCs具有無限增殖和自我更新能力，能逃逸化學(xué)藥物治療作用，從而導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)［1～3］。近年來，隨著對(duì)LSCs細(xì)胞生物學(xué)特性的深入研究，CD123、CD96、CD44等一些在急性髓細(xì)胞白血病(AML)LSCs過表達(dá)的分子陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，為臨床上靶向治療白血病提供了重要依據(jù)。新近，又有文獻(xiàn)報(bào)道，AML LSCs高表達(dá)CD47，提示其是潛在的單克隆抗體治療靶點(diǎn)，而目前國(guó)內(nèi)罕見相關(guān)報(bào)道［1，3～5］。為系統(tǒng)地了解CD47在AML中的生物學(xué)特性，我們應(yīng)用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析其在AML LSCs中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)合臨床探討其意義。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象:(1)AML患者:自2009年3月～2011年10月筆者醫(yī)院確診的147例(除外急性早幼粒細(xì)胞白血病)AML患者，患者年齡12～78歲，中位年齡43歲，其中男性80例，女性67例。按FAB標(biāo)準(zhǔn)分別為:M0 8例、M1 21例、M2 43例、M4 30例、M5 35例、M6 10例。初診骨髓原始細(xì)胞32% ～99%?；煼桨?DA、HA等。所有患者均簽署知情同意書。(2)健康對(duì)照者:19名健康對(duì)照者包括9名骨髓移植供者，10名體檢者，其中男性13名，女性6名，年齡22～47歲，中位年齡32歲。

2.方法:(1)儀器與試劑:流式細(xì)胞儀FACSCaliburTM為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。小鼠 IgG1－(PE、FITC、Percp或APC)、CD34－APC、CD38－Percp、CD123－PE、CD90－FITC、CD33－FITC、P170－FITC、CD117－FITC、CD13－FITC、CD15－FITC、 CD11b－FITC、CD64－FITC、CD14－FITC、CD20－FITC、CD22－FITC、CD3－FITC、CD7－FITC、CD5－FITC、CD2－FITC購(gòu)自美國(guó)BD公司。CD47－FITC購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。(2)標(biāo)本采集:化療前采骨髓2～5m l肝素鈉抗凝，常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，用磷酸鹽緩沖液制成細(xì)胞濃度為1×107/ m l的單細(xì)胞懸液備用。(3)單克隆抗體標(biāo)記及流式分析:正常對(duì)照和病例樣本用CD34－APC/CD38－Percp散點(diǎn)圖設(shè)CD34+CD38－細(xì)胞門，然后再分析 CD47、CD123、CD117、CD90、P170、CD33、CD13、CD11b、CD15、CD64、CD14、CD20、CD22、CD7、CD3、CD5、CD2等抗原表達(dá)。用流式細(xì)胞儀和Cell Quest軟件獲取并分析30000～400000個(gè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞。結(jié)果:CD47用平均熒光強(qiáng)度(MFI)和百分率表示，以≥20.00%為陽性。P170用百分率表示，以≥10.00%為陽性。其余抗原用百分率表示，以≥20.00%為陽性。(4)隨訪:對(duì)131例AML患者進(jìn)行跟蹤隨訪，統(tǒng)計(jì)復(fù)發(fā)、死亡病例，記錄生存時(shí)間。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)分析，計(jì)量資料呈偏態(tài)分布，用［中位數(shù)M(P2.5～P97.5)］表示，進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。用直線相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。AML患者總生存率比較采用Kaplan－Meier生存分析和Logrank檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.CD47在健康對(duì)照者骨髓造血干細(xì)胞中的表達(dá):19名健康對(duì)照者骨髓原始細(xì)胞 Lin－CD34+CD38－(HSC)亞群中CD47的表達(dá)百分率為15.42% (6.63% ～20.23%)，其中 CD47陽性僅 4例(21.05%)，結(jié)果顯示HSC CD47表達(dá)陽性率很低。

2.CD47在AML患者原始細(xì)胞中的表達(dá):147例 AML患者骨髓原始細(xì)胞Lin－CD34+CD38－(LSCs)亞群中CD47陽性112例，占76.19%，與健康對(duì)照組HSC細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.30，P＜0.01)。根據(jù) FAB分型，8例 M0中 7例陽性(87.50%)，21例M1中16例陽性(76.19%)，43例M2中33例陽性(76.74%)，30例M4中21例陽性(70.00%)，35例M5中27例陽性(77.14%)，10例M6中9例陽性(90.00%)。CD47在AML各亞型LSCs的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.08，P＞0.05)(表1)。CD47在LSCs表達(dá)百分率和MFI均高于CD34+CD38+亞群(U值分別為4.90、3.03，P均﹤0.01)，也遠(yuǎn)高于正常造血干細(xì)胞中的表達(dá)水平(U值分別為4.76、6.24，P均﹤0.01)(表2、圖1)。表明CD47在LSCs的表達(dá)量明顯增多。

表1 CD47在AM L亞型LSCs中的表達(dá)情況

表2 CD47在健康對(duì)照和AM L患者中不同細(xì)胞亞群上的表達(dá)情況

3.CD47和P170在AML LSCs中表達(dá)的相關(guān)性:147例AML患者骨髓LSCs CD47的表達(dá)率與多藥耐藥蛋白P170的表達(dá)率呈顯著正相關(guān)(r=0.83，P＜0.01)。

4.CD47在AML LSCs中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系:CD47與AML患者性別、年齡、原始細(xì)胞數(shù)量無關(guān)(P均 ＞0.05)。AML患者有肝、脾、淋巴結(jié)大者CD47陽性率高于無肝、脾、淋巴結(jié)大者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.77，P＜0.01)。外周血白細(xì)胞≥20.0 ×109/L AML患者 CD47的陽性率 ＜20.0×109/L AML患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.07，P＜0.05) (表3)。提示，CD47過表達(dá)的AML患者易髓外浸潤(rùn)。

圖1 CD47在AM L LSCs中的表達(dá)

表3 CD47在AM L LSCs中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

5.CD47在AML LSCs中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系: 147例AML患者中，除外16例因放棄治療或轉(zhuǎn)外院治療失訪，共計(jì)131例入組進(jìn)行為期1～31個(gè)月的隨訪。根據(jù)CD47在AML LSCs中表達(dá)的陽性和陰性分為兩組:CD47陽性的AML患者99例，CD47陰性的AML患者32例。99例CD47陽性的AML患者中有46例復(fù)發(fā)占46.46%，32例CD47陰性的AML患者中有8例復(fù)發(fā)占25.00%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.60，P＜0.05)。隨訪31個(gè)月后，99例CD47陽性的AML患者中共43例死亡，占43.43%，32例 CD47陰性的 AML患者中共 6例死亡，占18.75%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.29，P＜0.05);生存分析顯示，CD47陽性的AML患者平均生存時(shí)間18.99±1.15個(gè)月，低于CD47陰性的AML患者平均生時(shí)間24.90±1.87個(gè)月差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明CD47過表達(dá)的AML預(yù)后差，生存時(shí)間短。

圖2 AM L患者LSCs CD47表達(dá)的生存分析

討論

CD47又稱整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白，是一種廣泛表達(dá)的細(xì)胞膜表面的免疫球蛋白樣蛋白質(zhì)，是由特定的整聯(lián)蛋白、G蛋白及膽固醇組成的超分子復(fù)合物［6］。與其配體信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白(SIRPa)結(jié)合可產(chǎn)生抑制性信號(hào)，下調(diào)巨噬細(xì)胞的吞噬活性，進(jìn)而對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用［7，8］。正常造血干細(xì)胞表面CD47的少量表達(dá)有助于維護(hù)機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)的相對(duì)穩(wěn)定，而AML患者的LSCs表面由于CD47的過量表達(dá)能夠抵御自身被巨噬細(xì)胞吞噬，從而極大地降低了機(jī)體固有免疫系統(tǒng)對(duì)LSCs的清除［9］。

Jaiswal等［5］報(bào)道，AML及CML急變期LSCs的CD47表達(dá)水平較正常的HSC明顯增加，而其他的骨髓增殖性疾病的骨髓干/祖細(xì)胞的CD47表達(dá)都未見增加。我們的結(jié)果顯示，147例AML患者LSCs亞群中CD47陽性112例，占76.19%，明顯高于健康對(duì)照組HSC CD47的陽性率。進(jìn)一步分析AML患者原始細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CD47在LSCs的表達(dá)量顯著高于CD34+CD38+亞群，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。本組AML患者LSCs CD47的陽性率與FAB分型亞型無關(guān)，與耐藥蛋白P170則顯著相關(guān)。Majeti等［10］研究也顯示LSCs表面的CD 47表達(dá)水平通常與AML患者的FAB或M ICM分型無關(guān)，有t(8;21)(q22;q22)等臨床預(yù)后較好的核型異常的患者CD47低表達(dá)，而有FLT3－ITD突變及1/3正常核型的AML患者中CD47卻高表達(dá)。上述結(jié)果提示CD47的高表達(dá)可能與耐藥、預(yù)后相關(guān)。此外，通過臨床特征分析，我們還發(fā)現(xiàn)，CD47與AML患者性別、年齡、原始細(xì)胞數(shù)量無關(guān)，與肝、脾、淋巴結(jié)大及外周血高白細(xì)胞有關(guān)。提示，LSCs CD47過表達(dá)的AML患者易髓外浸潤(rùn)。

Majeti等［10］報(bào)道，成人AML患者經(jīng)8年隨訪后發(fā)現(xiàn)，LSCs表面高表達(dá)CD47的患者無事件中位生存時(shí)間是6.8個(gè)月，總中位生存時(shí)間9.1個(gè)月，CD47低表達(dá)的患者無事件中位生存時(shí)間是17.1個(gè)月，總中位生存時(shí)間22.1個(gè)月，顯示CD47低表達(dá)患者的生存時(shí)間比高表達(dá)的患者明顯延長(zhǎng)。本研究組131例AML患者隨訪31個(gè)月，結(jié)果顯示，99例 LSCs CD47陽性的AML患者復(fù)發(fā)率(46.46%)和病死率(43.43%)高于 32例 CD47陰性患者的復(fù)發(fā)率(25.00%)和病死率(18.75%)?？偵鏁r(shí)間分析顯示，CD47陽性的 AML患者平均生存時(shí)間18.99± 1.15個(gè)月，低于CD47陰性的AML患者平均生時(shí)間24.90±1.87個(gè)月 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。進(jìn)一步證實(shí)LSCs CD47陽性的AML患者易復(fù)發(fā)，生存時(shí)間縮短、預(yù)后差。

總之，AML患者LSCs表面CD47普遍過表達(dá)，造成臨床上治療反應(yīng)差，易復(fù)發(fā)、耐藥、生存時(shí)間短、預(yù)后差。然而，CD47在LSCs細(xì)胞中的高表達(dá)也為單克隆抗體靶向治療AML提供了依據(jù)，目前相關(guān)體外研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已取得重要進(jìn)展。

1 Jordan CT，Upchurch D，Szilvassy SJ，et al.The interleukin－3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells［J］.Leukemia，2000，14(10):1777－1784

2 Van Rhenen A，Moshaver B，Kelder A，et al.Aberrantmarker expression patterns on the CD34+CD38－stem cell compartment in acutemyeloid leukemia allows to distinguish themalignant from the normal stem cell compartment both at diagnosis and in remission［J］.Leukemia，2007，21(8):1700－1707

3 Hosen N，Park CY，Tatsumi N，et al.CD96 is a leukemic stem cell specific marker in human acutemyeloid leukemia［J］.Proc Nat Acad Sci USA，2007，104(26):11008－11013

4 J in L，Hope KJ，ZhaiQ，etal.Targeting of CD44 eradicates human acutemyeloid leukemic stem cells［J］.Nat Med，2006，12(10): 1167－1174

5 Jaiswal S，Jam ieson CH，PangWW，et al.CD47 is up regulated on circulating hematopoietic stem cells and leukem ia cells to avoid phagocytosis［J］.Cell，2009，138(2):271－285

6 Brown EJ，F(xiàn)razier WA.Integrin associated protein(CD47)and its ligands［J］.Trends Cell Biol，2001，11(3):130－135

7 Matozaki T，Murata Y，Okazaw a H，et al.Functions and molecular mechanisms of the CD472S IRPalpha signalling pathway［J］.Trends Cell Biol，2009，19(2):72－80

8 Barclay AN，Brown MH.The SIRP family of receptors and immune regulation［J］.Nat Rev Immunol，2006，6(6):457－464

9 Cumano A，Godin I.Ontogeny of the hematopoietic system［J］.Annu Rev Immunol，2007，25:745－785

10 Majeti R，Chao M P，A lizadeh AA，et al.CD47 is an adversep rognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemiastem cells［J］.Cell，2009，138(2):286－299