HCV不同標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果比較分析

李 華 龍潤(rùn)?quán)l(xiāng) 楊 蓉 蔣蕊鞠 董承紅 易紅昆 白慧珠 謝忠平

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起的重要的世界性傳染病之一，在中國(guó)人群的感染率達(dá)3.2%，其中50%～85%感染者發(fā)展為慢性丙型肝炎，10%～30%發(fā)展為肝硬化，肝硬化患者中約3% ～10%可演變?yōu)楦渭?xì)胞癌［1］。HCV初發(fā)感染往往比較隱匿，僅有約20%～30%的感染者呈急性肝炎表現(xiàn)，所以選擇快速、靈敏、特異的檢測(cè)方法檢出HCV十分重要［2，3］。本研究應(yīng)用HCV核心抗原試劑盒、HCV游離抗原試劑盒、丙型肝炎病毒(HCV)抗體檢測(cè)試劑盒(ELISA)及HCV核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑盒，對(duì)1551份血清或血漿臨床樣品檢測(cè)丙型肝炎病毒不同的標(biāo)志物，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料與方法

1.材料:(1)血清或血漿標(biāo)本來(lái)源:云南省第一人民醫(yī)院、昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬人民醫(yī)院及云南省血液中心3個(gè)單位的血清或血漿樣品。(2)丙型肝炎病毒核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑:深圳匹基生物工程有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20080702。(3)丙型肝炎病毒核心抗原診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法):國(guó)內(nèi)某公司上市產(chǎn)品，批號(hào)20091101。(4)丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒(ELISA):上海科華生物工程有限公司生產(chǎn)，批號(hào)200908011。(5)丙型肝炎病毒游離抗原檢測(cè)試劑盒(ELISA):中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生產(chǎn)。

2.方法:(1)丙型肝炎病毒核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè):采用丙型肝炎病毒核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。(2)丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè):按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行ELISA檢測(cè)HCV－Ag。(3)丙型肝炎病毒抗體檢測(cè):按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 ELISA檢測(cè)HCV－Ab。(4)丙型肝炎病毒游離抗原檢測(cè):包被HCV多表位復(fù)合抗原的多克隆抗體酶標(biāo)板，先加入樣品緩沖液50μl，待檢樣品50μl，37℃孵育2h，洗板5次后，加酶結(jié)合物100微升/孔，37℃孵育1h。洗板5次后，加TMB顯色液，室溫顯色15min，于450nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。

結(jié)果

1.HCV不同標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果分析:在1551份血清或血漿樣品中，共檢出HCV－Ab陽(yáng)性樣品565份、HCV－Ag陽(yáng)性樣品48份、HCV－RNA陽(yáng)性樣品317份、HCV－CAg陽(yáng)性25樣品。其中，HCV－Ab陽(yáng)性樣品(陽(yáng)性率36.43%)檢出率高于HCV－Ag陽(yáng)性樣品(陽(yáng)性率3.09%，χ2=543.422，P=0.000)、HCVCAg陽(yáng)性樣品(陽(yáng)性率1.61%，χ2=610.320，P= 0.000)及HCV－RNA陽(yáng)性樣品(陽(yáng)性率20.445%，χ2=97.437，P=0.000)，2種試劑檢出率皆顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HCV－Ag陽(yáng)性樣品檢出率(3.09%)高于HCV－CAg陽(yáng)性樣品(1.61%)，2種試劑檢出率顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.421，P=0.006); HCV－RNA陽(yáng)性樣品(20.44%)檢出率高于HCVAg陽(yáng)性樣品(3.09%)，2種試劑盒檢出率顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=224.687，P=0.000);HCV－RNA陽(yáng)性樣品(20.44%)檢出率高于HCV－CAg陽(yáng)性樣品(1.61%)，2種試劑檢出率顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=280.203，P=0.000，表1)。

2.HCV－Ab指標(biāo)相關(guān)性檢測(cè)結(jié)果分析:在565份HCV－Ab陽(yáng)性樣品中，檢出48份HCV－Ag(游離抗原)陽(yáng)性樣品，檢出率為8.50%;檢出23份HCV核心抗原(HCV－CAg)陽(yáng)性樣品，檢出率為4.07%;檢出317份HCV－RNA陽(yáng)性樣品，檢出率為56.11%。在984份全陰性樣品中，檢出2份HCV核心抗原(HCVCAg)陽(yáng)性樣品，檢出率為0.20%;但未檢出HCV抗原及HCV－RNA(表2)。以上結(jié)果說(shuō)明:HCV－RNA、HCV－Ag及HCV－CAg在HCV－Ab陽(yáng)性樣品中的檢出率明顯高于HCV－Ab陰性樣品，具有明顯的關(guān)聯(lián)性。

表2 HCV抗原檢測(cè)試劑盒臨床研究不同性質(zhì)樣品結(jié)果分析

3.兩種HCV抗原檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果分析:在317份HCV－Ab及HCV－RNA雙陽(yáng)性的樣品中，HCV抗原檢測(cè)試劑檢出34份HCV游離抗原陽(yáng)性樣品(陽(yáng)性率10.73%)，HCV核心抗原檢測(cè)試劑檢出23份HCV核心抗原陽(yáng)性樣品(陽(yáng)性率7.26%)，HCV抗原檢測(cè)試劑檢出率高于HCV核心抗原檢測(cè)試劑，但2種試劑檢出率顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 2.333，P=0.1267)。

在248份HCV－Ab陽(yáng)性、但HCV－RNA陰性的樣品中，HCV抗原檢測(cè)試劑檢出14份HCV游離抗原陽(yáng)性樣品(陽(yáng)性率5.65%)，HCV核心抗原檢測(cè)試劑未檢出陽(yáng)性樣品(陽(yáng)性率0)，2種試劑檢出率有明顯差異(χ2=14.407，P=0.0001)。

在984份HCV－Ab及HCV－RNA雙陰性的樣品中，HCV抗原檢測(cè)試劑未檢出陽(yáng)性樣品(陽(yáng)性率0)，HCV核心抗原檢測(cè)試劑檢出2份HCV核心抗原陽(yáng)性樣品(陽(yáng)性率0.20%)，2種試劑檢出率無(wú)明顯差異(校正χ2=0.501，P=0.479，表3)。

表3 2種HCV抗原檢測(cè)試劑對(duì)不同樣品檢測(cè)結(jié)果分析

4.HCV－Ab與HCV－RNA檢測(cè)結(jié)果關(guān)聯(lián)性分析:將本次所有樣品HCV－RNA(熒光定量PCR)與 HCV－Ab(ELISA)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，若以HCVRNA結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，則與用于HCV－Ab(ELISA)檢測(cè)結(jié)果一致性84.01%、靈敏度100.00%、特異度79.90%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值 56.11%、陰性預(yù)測(cè)值100.00%。HCV－Ab(ELISA)檢出率(36.43%)明顯高于核酸檢出率(20.44%)。二者之間差異經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)有顯著性(χ2=248.0，P=0.0000);對(duì)兩種檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，兩種檢測(cè)結(jié)果明顯相關(guān)，其r =0.6696(χ2=691.9，P=0.0000)。若以HCV－Ab結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，則與HCV－RNA(熒光定量PCR)檢測(cè)結(jié)果一致性、靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值分別為84.01%、56.11%、100.00%、100.00%及79.90%。此結(jié)果提示，由于檢測(cè)原理及檢測(cè)的病毒標(biāo)志物不同，熒光定量PCR與ELISA法檢測(cè)結(jié)果之間存在一定的差異，并不能完全吻合而取代，也許更重要的是相互補(bǔ)充(表4)。

表4 HCV－Ab與HCV－RNA檢測(cè)結(jié)果分析

討論

HCV感染的實(shí)驗(yàn)室檢查是丙型肝炎診斷的重要依據(jù)，所以檢測(cè)方法的選擇非常重要。HCV感染通常是持續(xù)性的終生感染，抗體檢測(cè)是一個(gè)非常有效的方法，但由于存在“窗口期”及“靜默感染”，此期檢測(cè)不到相應(yīng)的抗體，所以仍然有輸血后丙肝的發(fā)生［4～6］。國(guó)外資料報(bào)道ELISA法檢測(cè)HCV核心抗原比檢測(cè)HCV抗體縮短窗口期平均58.2天，僅比RT－PCR檢測(cè)HCV－RNA多0.24～3.33天，而抗體出現(xiàn)則比檢測(cè)到HCV－RNA晚28～140天［7］。反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)是一個(gè)很敏感的方法。HCV －RNA可以在暴露后的1～2周被檢出［8］。另外，在一些HCV感染后恢復(fù)期的人群中，抗HCV可能會(huì)逐漸降低到檢測(cè)限之下，或免疫功能低下的HCV感染者，抗HCV會(huì)持續(xù)陰性，這時(shí)，HCV－RNA的檢測(cè)是感染的唯一證據(jù)［9］。故使用RT－PCR技術(shù)檢測(cè)HCV－RNA是判斷感染最有效的方法。但其技術(shù)復(fù)雜、條件要求較高，不易在多數(shù)實(shí)驗(yàn)室推廣。HCV抗原(HCV－Ag)包括核心抗原(HCV－CAg)、NS5、NS3及NS4等，是HCV感染者體內(nèi)出現(xiàn)的早期感染標(biāo)志，其消長(zhǎng)趨勢(shì)與HCV－RNA有明顯的一致性，具有早期診斷的重要價(jià)值［7］。HCV－Ag或HCV－CAg的檢測(cè)有助于評(píng)價(jià)HCV在細(xì)胞中的表達(dá)情況。ELISA法較PCR法簡(jiǎn)便、快速，其方法簡(jiǎn)單、影響因素少、重復(fù)性好。因此，在不具備RNA檢測(cè)條件的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展HCV－CAg檢測(cè)或HCV－Ag檢測(cè)是很好的篩查方法。

本研究在1551份血清或血漿樣品中，共檢出HCV－Ab陽(yáng)性樣品565份(陽(yáng)性率為36.43%)、HCV－RNA陽(yáng)性樣品317份(陽(yáng)性率為20.445%)，2種試劑檢出率顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=97.437，P =0.000)。HCV－RNA較HCV－Ab檢出率低，原因是由于本實(shí)驗(yàn)采集的樣品部分為特殊樣品，且在HCV的3種標(biāo)志物中，RNA不穩(wěn)定，而核酸的穩(wěn)定性較抗體差，導(dǎo)致在進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)時(shí)，樣品的檢出率降低［10，11］。

在317份HCV－Ab和HCV－RNA雙陽(yáng)性樣品及984份HCV－Ab和HCV－RNA雙陰性樣品，HCV－Ag及HCV－CAg 2種標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果檢出率差異皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此說(shuō)明HCV－Ag檢測(cè)與HCVCAg檢測(cè)結(jié)果有高度的相關(guān)性。但在565份HCVAb陽(yáng)性樣品中檢出48份 HCV－Ag(檢出率為8.50%)，23份HCV－CAg(檢出率為4.07%)，2種試劑檢出率有明顯差異(χ2=9.393，P=0.0022);在248份HCV－Ab陽(yáng)性、但HCV－RNA陰性的樣品中，未檢測(cè)出HCV－CAg陽(yáng)性樣品，而HCV抗原檢測(cè)試劑檢出14份，陽(yáng)性率達(dá)5.65%，2種試劑檢出率有明顯差異(P=0.000)。可能是因?yàn)镠CV－Ag檢測(cè)試劑所使用的抗體為HCV多表位復(fù)合抗原的多克隆抗體，除C表位外，尚有NS3、NS5等多個(gè)表位，相對(duì)于HCV核心抗原的單克隆而言，捕獲能力強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度提高。

綜合比較分析，HCV的抗原、抗體及核酸標(biāo)志物之間是相互關(guān)聯(lián)的，任何單一標(biāo)志物的檢測(cè)均存在漏檢風(fēng)險(xiǎn)，HCV－CAg試劑與HCV－Ag試劑可作為HCV－Ab檢測(cè)的補(bǔ)充試劑，可聯(lián)合應(yīng)用于臨床檢測(cè)及血源篩選，但其靈敏度有待提高［12］。

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