鹽酸苯達莫司汀的電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析

劉珍仁，葉曉嵐，2，范國榮＊，張大志，黃景華

［1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海市藥物（中藥）代謝產(chǎn)物研究重點實驗室，上海200433；2.廣東藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，廣州510006；3.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機化學(xué)教研室，上海200433；4.廣東八加一醫(yī)藥有限公司，廣州510515］

鹽酸苯達莫司汀（bendamustine hydrochlo－ride，BDH），化學(xué)名：4－｛5′－［雙－（2′′－氯乙基）氨基］－1′－甲基－2′－苯并咪唑基｝－丁酸鹽酸鹽，最早于19世紀60年代初由Ozegowski及其同事在德國耶拿的微生物試驗協(xié)會研制成功。他們使一種烷基化氮芥（一種非功能烷化劑）連接一個嘌呤和氨基酸，變成一種雙功能基烷化劑，通過烷化作用使DNA單鏈和雙鏈交聯(lián)，干擾DNA的功能和合成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［1］，其化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。

圖1 鹽酸苯達莫司汀的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structure of bendamustine hydrochloride

BDH作為新一代抗癌藥物，對多種癌癥具有明顯的治療作用，可用于治療霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細胞性白血病和乳腺癌等多種惡性腫瘤。美國FDA于2008－03－21批準Cephalon公司開發(fā)的BDH用于慢性淋巴細胞性白血病的治療，商品名為Treanda。2008－10－31該藥又獲準用于惰性B細胞非霍奇金淋巴瘤的治療［2］。2010年，Mundipharma公司宣布，歐洲醫(yī)藥管理局（EMEA）推薦在德國及歐盟其他成員國，如奧地利、比利時、丹麥等批準BDH用于治療惰性非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病及多發(fā)性骨髓瘤［3］。目前，BDH尚未在中國大陸申請專利，也沒有制藥企業(yè)進行生產(chǎn)和銷售，因此本品開發(fā)的潛力巨大。

目前大部分文獻主要涉及BDH的藥理、臨床藥效以及體內(nèi)外代謝的研究［4－7］，但對于其質(zhì)譜裂解規(guī)律尚未見報道。為了研究BDH的結(jié)構(gòu)特征及其裂解途徑，本研究采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（ESI－MSn）技術(shù)對BDH質(zhì)譜裂解途徑進行分析，找出主要的特征碎片離子及其質(zhì)譜電離裂解規(guī)律，為BDH的結(jié)構(gòu)修飾及其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)判斷提供依據(jù)。

1 儀器和試劑

1.1 儀器 LCQ fleet質(zhì)譜儀、ESI離子源、離子阱質(zhì)量分析器和XcaliburTM2.0.7SP1數(shù)據(jù)處理軟件（美國Thermo Fisher公司），XW－80A渦旋混合器（上海精科實驗有限公司），XS205電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥 BDH原料藥（批號：20110523，純度99.87%，由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機化學(xué)教研室提供）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；超純水由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室自制。

2 方法和結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件

2.1.1 正離子模式 電噴霧電壓4.5kV；鞘氣流速241.15kPa；輔助氣流速2.4L／min；毛細管溫度350℃；毛細管電壓35V；透鏡電壓95V；碰撞誘導(dǎo)解離能量35V。

2.1.2 負離子模式 電噴霧電壓－4.5kV；鞘氣流速241.15kPa；輔助氣流速－2.4L／min；毛細管溫度350℃；毛細管電壓－35V；透鏡電壓－95V；碰撞誘導(dǎo)解離能量35V。

2.2 樣品溶液的配制 精密稱量BDH原料藥10mg，置于10ml棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得對照品儲備液。精密量取該儲備液適量，用甲醇逐級稀釋至1.0μg／ml的樣品溶液，備用。

2.3 BDH在正離子模式下的質(zhì)譜解析 將1.0μg／ml的BDH甲醇溶液直接注入質(zhì)譜儀，質(zhì)譜檢測器調(diào)為正離子模式，獲得其一級全掃描質(zhì)譜圖。從中可以觀察到分子離子峰［M＋H］＋m／z 358。同時在一級質(zhì)譜圖中可以看到較強的離子峰m／z 360和m／z362，這是由于BDH結(jié)構(gòu)中有2個Cl，而同位素37Cl的豐度比很大。根據(jù)同位素豐度比公式，即二項式（a＋b）n（a與b為輕質(zhì)35Cl及重質(zhì)同位素37Cl的豐度比，n為Cl原子數(shù)目），BDH一級質(zhì)譜圖中會出現(xiàn)M、M＋2及M＋4峰，且豐度比為9∶6∶1，與質(zhì)譜圖中的結(jié)果吻合，即［M＋H＋2］＋m／z360、［M＋H＋4］＋m／z362分別是含1個和2個同位素37Cl的分子離子峰。

在二級全掃描質(zhì)譜圖中，可以觀察到m／z 340為最強離子峰，結(jié)合系統(tǒng)自帶的質(zhì)譜解析軟件，此離子峰為準分子離子［M＋H］＋m／z358失去一分子H2O生成的產(chǎn)物離子［M＋H－18］＋。三級全掃描質(zhì)譜顯示有3個主要離子峰m／z 304、m／z 276和m／z228。離子峰m／z 304是二級離子碎片m／z 340失去一分子HCl而生成的產(chǎn)物離子；m／z 276是二級碎片離子m／z340先失去一分子CO后再失去一分子HCl而得到的離子碎片；m／z 228為離子碎片m／z 358斷裂一分子CH2CH2Cl和一分子CH2Cl得到m／z 246的離子碎片，m／z 246再失去一分子H2O后得到m／z 228碎片離子峰。在四級全掃描質(zhì)譜圖中，主要有m／z 240、m／z 268和m／z 276 3個碎片離子峰，均是三級離子碎片m／z 304分別失去一分子CH2CH2Cl、HCl和CH2＝CH2生成的產(chǎn)物離子。從圖中可以發(fā)現(xiàn)三級和四級質(zhì)譜棒圖中均有m／z276離子碎片峰，說明該離子碎片既可以由m／z 340裂解產(chǎn)生，也可以從m／z 304離子碎片裂解生成。其中正離子模式下質(zhì)譜裂解棒圖見圖2，化合物裂解碎片結(jié)構(gòu)見圖3，裂解碎片結(jié)構(gòu)樹見圖4。

圖2 鹽酸苯達莫司汀正離子模式下的多級質(zhì)譜圖Figure 2 MS／MSn photograms of bendamustine hydrochloride in positive ion mode

圖3 鹽酸苯達莫司汀正離子模式下的裂解途徑Figure 3 Fragmentation pathways of bendamustine hydrochloride in positive ion mode

圖4 m／z 358的分子離子在正離子模式下的碎片裂解結(jié)構(gòu)樹Figure 4 Fragmentation crack tree of molecular ion m／z 358in positive ion mode

2.4 BDH在負離子模式下的質(zhì)譜解析 將1.0μg／ml的BDH甲醇溶液直接注入質(zhì)譜儀，質(zhì)譜檢測器調(diào)為負離子模式，獲得其一級全掃描質(zhì)譜圖（見圖5）。從中可以觀察到分子離子峰［M－H］－m／z 356，還可以看到同位素37Cl的分子離子峰［M－H＋2］－m／z358和［M－H＋4］－m／z360。二級選擇m／z356作為母離子進行轟擊，質(zhì)譜圖上基本無響應(yīng)。

圖5 鹽酸苯達莫司汀負離子模式下的一級質(zhì)譜圖Figure 5MS photogram of bendamustine hydrochloride in negative ion mode

3 討 論

利用ESI－MSn，根據(jù)軟電離模式下能產(chǎn)生多級離子碎片的特點，可以推測BDH的裂解方式和碎片離子結(jié)構(gòu)。BDH結(jié)構(gòu)中的羥基、羰基以及氯乙基等位置容易發(fā)生斷裂，產(chǎn)生一系列碎片離子。BDH在體內(nèi)經(jīng)水解后的代謝產(chǎn)物主要是羥基取代氯原子［8］，這與BDH在質(zhì)譜中容易發(fā)生裂解的位置很相似，因此BDH的質(zhì)譜裂解規(guī)律對其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)判定有一定的提示作用。

由于BDH結(jié)構(gòu)中有一個羧基，在正離子模式下，羧基易以CO和H2O的形式丟失；5′位C上的N直接相連的兩個氯乙基中的氯原子也容易以HCl的形式脫去；同時氯乙基也可以通過斷裂與氯原子相鄰的亞甲基的方式進行裂解，或者氯乙基直接斷裂，說明這幾個位置都容易發(fā)生裂解產(chǎn)生新的離子碎片。而其中苯并咪唑環(huán)比較穩(wěn)定，通過多級質(zhì)譜裂解，均未發(fā)現(xiàn)與其相關(guān)的裂解碎片。

負離子模式下，通過多級能量轟擊，只有一級分子離子峰［M－H］－m／z 356有一定的響應(yīng)，ESI－MS2后基本上無響應(yīng)，分別增加樣品濃度和進樣量，響應(yīng)也未發(fā)生明顯的增加，說明BDH主要通過正離子模式進行裂解產(chǎn)生碎片，負離子模式下則比較穩(wěn)定，各鍵不容易發(fā)生斷裂。這與BDH結(jié)構(gòu)中含有3個N原子有關(guān)，容易失去電子而帶正電荷。

總之，本研究采用ESI－MSn對BDH的質(zhì)譜裂解方式做了初步的分析，為BDH的結(jié)構(gòu)修飾及其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)判斷提供了參考依據(jù)。

［1］ Eichbaum M，Bischofs E，Nehls K，et al.Bendamustine hydrochloride－a renaissance of alkylating strategies in anticancer medicine［J］.Drugs Today（Barc），2009，45（6）：431－444.

［2］ National Cancer Institute.Cancer drug information：FDA approval for bendamustine hydrochloride［EB／OL］.（2008－03－20）［2012－02－26］.http：／／www.cancer.gov／cancertopics／druginfo／fda－bendamustine－h(huán)ydrochloride.

［3］ 佚 名.CHMP推薦批準苯達莫司汀治療血癌［J］.國外藥訊，2010，（4）：18－19.

Anon.CHMP recommended to give approval for bendamustine in the treatment of leukaemia［J］.World Pharm Newsletter，2010，（4）：18－19.In Chinese.

［4］ Schrijvers D，Vermorken J B.PhaseⅠstudies with bendamustine：an update［J］.Semin Oncol，2002，29（4Suppl 13）：15－18.

［5］ Chovan J P，Li Feng，Yu ErYa，et al.Metabolic profile of［14C］bendamustine in rat urine and bile：preliminary structural identification of metabolites［J］.Drug Metab Dispos，2007，35（10）：1744－1753.

［6］ Ogura M，Uchida T，Taniwaki M，et al.PhaseⅠand pharmacokinetic study of bendamustine hydrochloride in relapsed or refractory indolent B－cell non－Hodgkin lymphoma and mantle cell lymphoma［J］.Cancer Sci，2010，101（9）：2054－2058.

［7］ Dennie T W，Kolesar J M.Bendamustine for the treatment of chronic lymphocytic leukemia and rituximab－refractory，indolent B－cell non－Hodgkin lymphoma［J］.Clin Ther，2009，31Pt 2：2290－2311.

［8］ Teichert J，Baumann F，Chao Q，et al.Characterization of two phaseⅠmetabolites of bendamustine in human liver microsomes and in cancer patients treated with bendamustine hydrochloride［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2007，59（6）：759－770.