用微透析法測定氫溴酸東莨菪堿凝膠經(jīng)皮給藥大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究

陳 芳，胡晉紅，朱全剛（第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海200433）

咳喘膏是目前臨床常用于治療單純型慢性氣管炎、喘息型慢性氣管炎、哮喘（除心臟引起的）等癥的外用中藥復(fù)方制劑，由芥子、甘遂、延胡索、細(xì)辛、洋金花等中藥與適當(dāng)基質(zhì)制成。洋金花是其中一味非常重要的中藥，其主要有效成分東莨菪堿具有廣泛的藥理活性，如解痙、麻醉、止痛等。為進一步研究咳喘膏經(jīng)皮給藥的體內(nèi)過程，本研究將氫溴酸東莨菪堿制成凝膠制劑，用微透析取樣技術(shù)研究其在大鼠皮膚內(nèi)的藥動學(xué)過程。

經(jīng)皮微透析技術(shù)可以對實驗動物或人體皮膚組織進行在體、連續(xù)的藥物濃度測定，現(xiàn)已被廣泛用于外用制劑的在體經(jīng)皮吸收動力學(xué)研究。但所收集的微透析樣品中藥物濃度非常低，一般在納克每毫升甚至皮克每毫升范圍，并且由于微透析流速低，所收集的樣品量一般只有幾微升至幾十微升。樣品量少、濃度低的特點對建立分析方法提出了挑戰(zhàn)［1］。HPLC－MS／MS法具有靈敏度高、特異性強、樣品需求量少的特點。本研究建立了HPLC－MS／MS法測定微透析樣品中東莨菪堿的濃度，并研究了氫溴酸東莨菪堿凝膠的大鼠經(jīng)皮給藥藥動學(xué)過程。

1 材 料

1.1 藥物和試劑 氫溴酸東莨菪堿原料藥（廣州環(huán)葉制藥有限公司，批號070301）；氫溴酸東莨菪堿對照品（德國MSDS公司，純度≥98%）；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；甲酸銨、甲酸和三乙醇胺（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－2Na），磷酸氫二鈉（汕頭金沙化工一廠）；磷酸二氫鈉（新華化工廠）；NaCl（泰昌美達試劑有限公司）；卡波姆（美國Lubrizol公司）；羥苯乙酯（湖北合天化工有限公司）；丙二醇（宜興市毅達化工廠）；月桂氮酮（湖北南星化工總廠）。氫溴酸東莨菪堿凝膠由第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部實驗室自制。

1.2 儀器 G－6410AHPLC－MS／MS聯(lián)用儀（配有三重四級桿LC－MS系統(tǒng)、G1311四元泵、G1322真空泵、G1329A自動進樣器和G1316A柱溫箱），Zorbax Extend C18保護柱，Zorbax Extend C18色譜柱（美國安捷倫公司）。微透析系統(tǒng)：MD1001灌注器推進泵、MD0100灌注器、MD1002灌注器支架和MD1020流速控制器（美國BAS公司）。Franz擴散池（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院有機所玻璃車間加工制備）。

1.3 實驗動物 雄性SD大鼠，體重約200g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證號SCXK（滬）2007－0003。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 Zorbax Extend C18色譜柱（100mm×2.1mm，3.5μm），Zorbax Extend C18保護柱（12.5mm×2.1mm，5μm），流動相：甲醇－2mmol／L甲酸銨（25∶75，用甲酸調(diào)節(jié)pH 3.5），流速：0.3ml／min；進樣量：1μl；柱溫40℃。

2.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧電離源（ESI），正離子掃描方式及多離子反應(yīng)方式檢測；離子源溫度350℃；鞘氣（N2）流速8L／min；霧化氣壓30Pa；毛細(xì)管電壓4 000V；檢測時間3min。在一級全掃描質(zhì)譜圖中獲得氫溴酸東莨菪堿準(zhǔn)分子離子峰為m／z 304.1，選擇性對其進行二級質(zhì)譜分析，得到主要碎片離子為m／z138.0（見圖1），儀器自動優(yōu)化相對碰撞能量為23。將上述離子對用于定量分析。

2.3 磷酸鹽緩沖液溶液（PBS）的配制 分別稱取磷酸二氫鈉0.775g，磷酸氫二鈉3.171g，氯化鈉5.58g溶解于蒸餾水中，定容至1 000ml，用0.45μm的水系微孔濾膜過濾即得pH 7.4的PBS。2.4 儲備液、對照品溶液、質(zhì)控溶液的配制 精密稱取適量氫溴酸東莨菪堿對照品置于100ml容量瓶中，用PBS溶解并稀釋至刻度，配制成10μg／ml的東莨菪堿儲備液。依次精密量取該儲備液適量，置于10ml容量瓶中，用PBS稀釋至刻度，搖勻，配制成5、10、20、50、100、200、500、1 000ng／ml的對照品溶液。同法配制20、100、500ng／ml的東莨菪堿質(zhì)控溶液。

圖1 東莨菪堿的HPLC－MS／MS譜圖Figure 1 HPLC－MS／MS photogram of scopolamine

2.5 微透析樣品處理 取5μl微透析溶液加入45μl PBS，混勻，渦旋3min，取5μl進行HPLC－MS／MS分析。

2.6 氫溴酸東莨菪堿凝膠處方及制作方法 處方：氫溴酸東莨菪堿0.5g，卡波姆1g，EDTA－2Na 0.03g，羥苯乙酯0.1g，丙二醇10ml，月桂氮酮5ml，三乙醇胺0.5ml，蒸餾水適量。制作方法：精密稱取處方量氫溴酸東莨菪堿，用適量蒸餾水溶解，加入處方量卡波姆，溶脹過夜，此為1液。處方量EDTA－2Na用適量蒸餾水溶解，此為2液。將2液緩緩加入1液得3液。羥苯乙酯的丙二醇溶液緩慢加入3液，邊加邊攪拌。再先后加入月桂氮酮、三乙醇胺，用蒸餾水補足至100g，即得凝膠。

2.7 實驗動物處理 SD大鼠3只，體重約200g，實驗前一晚禁食。實驗前用25%烏拉坦溶液3ml／kg腹腔注射麻醉動物，固定動物后在腹部剃除毛發(fā)，置皮膚微透析探針，將探針連接于微透析裝置。

2.8 大鼠體內(nèi)東莨菪堿回收率測定 用含不同濃度東莨菪堿的PBS（約20、100、200ng／ml，HPLC－MS／MS法測定灌流液中具體濃度cperf）灌注探針，流速2μl／min，平衡1h后，每20min收集一次透析液，收集4個樣品后，更換高濃度的灌流液，依前面的方法平衡采樣，直至采集好3個濃度的樣品。HPLC－MS／MS進樣5μl，測定透析液中的藥物濃度（cdial），根據(jù)公式Rdial＝（cperf－cdial）／cperf計算濃度對東莨菪堿體內(nèi)回收率的影響。結(jié)果3種不同濃度東莨菪堿在大鼠體內(nèi)回收率分別為（35.21± 1.88）%、（33.14±4.60）%和（31.15±1.09）%（n＝3）。用含藥濃度為200ng／ml的PBS在不同流速下（1.0、1.5、2.0、3.0μl／min）灌注探針。每種流速收集前平衡1h，各收集5份微透析樣品，計算流速對東莨菪堿體內(nèi)回收率的影響。不同流速下東莨菪堿在大鼠體內(nèi)回收率分別為（90.34±2.53）%、（51.80±2.08）%、（29.62±2.79）%和（17.22± 2.70）%（n＝5）。

2.9 氫溴酸東莨菪堿凝膠體外經(jīng)皮滲透實驗 將透皮擴散池預(yù)熱至34℃，將大鼠皮膚置于裝有磁力攪拌子的Franz擴散池上，真皮層朝上。凝膠0.5g／池，均勻涂于皮膚表面，固定擴散池。在接收池中加入預(yù)熱至34℃的PBS，開磁力攪拌，開始計時，分別于1、2、4、6、8、12h從接收池中取出全部接收液，并及時補充等量34℃的PBS。接收液于5.71×10－3×g離心10min，然后進行檢測。結(jié)果凝膠中藥物透過皮膚的滲透曲線見圖2。以單位面積累計經(jīng)皮滲透量對時間進行線性回歸，得出凝膠劑中藥物經(jīng)皮滲透速率為112.14μg·cm－2·h－1，時滯為3.5h。

圖2 氫溴酸東莨菪堿凝膠大鼠體外經(jīng)皮滲透曲線Figure 2 The in vitro permeation curve of scopolamine hydrobromide gel in rats

2.10 氫溴酸東莨菪堿凝膠的經(jīng)皮吸收藥動學(xué)過程 用不含藥物的PBS灌注探針90min后，在透析窗正上方局部皮膚用0.5%氫溴酸東莨菪堿凝膠（1.25mg／cm2）包封，平衡30min后，每隔20min收集1次透析液，收集12h。該凝膠經(jīng)皮給藥后20min～12h內(nèi)均可檢測到東莨菪堿的存在，且給藥后藥物在皮膚內(nèi)濃度迅速升高，約150min時達到峰濃度，為（951.6±56.1）ng／ml，隨后下降但其濃度能穩(wěn)定在較高的水平（445～992ng／ml）。氫溴酸東莨菪堿在皮膚內(nèi)的t1／2為（174.2±77.3）min，AUC0～t為（355 764.4±38 138.9）ng·min·L－1，經(jīng)皮吸收動力學(xué)曲線見圖3。

2.11 方法學(xué)考察

2.1 1.1 方法專屬性 取大鼠空白皮膚下微透析樣品進行HPLC－MS／MS分析，大鼠腹部皮膚給予東莨菪堿凝膠2h后取皮膚下微透析樣品。結(jié)果表明，空白皮膚下未見待測物本底以及其他干擾物質(zhì)影響氫溴酸東莨菪堿的測定。

2.1 1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考文獻［2，3］，以PBS作為空白基質(zhì)，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品，得離子流圖。以待測物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以待測物的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），用加權(quán)（權(quán)重系數(shù)1／X2）最小二乘法進行回歸計算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y＝0.6 X＋0.001 6（r＝0.999 8）。東莨菪堿在5.0～1 000ng／ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖3 氫溴酸東莨菪堿凝膠經(jīng)皮吸收動力學(xué)曲線Figure 3 The percutaneous absorption kinetics curve of scopolamine hydrobromide gel n＝3

2.1 1.3 精密度實驗 取20、100、500ng／ml的質(zhì)控溶液，每個濃度進行5個樣本分析，連續(xù)測定3d，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的濃度，考察日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果其日內(nèi)RSD分別為1.81%、0.60%、0.57%（n＝5）；日間RSD分別為3.00%、0.33%、0.32%（n＝5），表明精密度良好。

3 討 論

微透析樣品體積小，所含被測物的濃度一般都比較低，因此對分析方法的靈敏度要求很高，HPLC－MS／MS法因其具有高效、快速、靈敏度高、特異性強的特點，因而在微透析樣品的分析中越來越受到重視。將探針埋置人皮下所造成的創(chuàng)傷是很輕微的，但是也有可能產(chǎn)生紅斑、組織中小分子物質(zhì)濃度和組織血液灌流量改變，影響研究結(jié)果。因此國外文獻報道在埋置探針后到局部給藥前應(yīng)有一段平衡時間，通常為60～90min［4，5］。

在微透析取樣方法中，探針回收率的準(zhǔn)確校正是獲得組織液內(nèi)真實藥物濃度的關(guān)鍵。最常用的用于校準(zhǔn)探針回收率的方法有慢流速法、零凈流量法、內(nèi)標(biāo)法和反向透析法。反向透析法由于更快速和更方便的優(yōu)勢而被廣泛用于體內(nèi)回收率的測定。本研究就是采用反向透析法測定探針的回收率，且從結(jié)果可以看出探針的回收率與藥物濃度無關(guān)。

從氫溴酸東莨菪堿凝膠體內(nèi)藥動學(xué)過程可以看出，該藥物能迅速透過皮膚被吸收，約在150min時即達到最高濃度，后緩慢下降但濃度能維持在一較高的范圍內(nèi)，隨后該藥物在皮下的濃度迅速下降，提示臨床使用該藥物時需注意給藥間隔。本研究成功建立了HPLC－MS／MS法檢測大鼠皮下微透析樣品中東莨菪堿的含量，并考察了氫溴酸東莨菪堿凝膠經(jīng)皮給藥后在皮下的藥動學(xué)過程。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，氫溴酸東莨菪堿凝膠的皮下濃度在各個探針和大鼠之間有差異，推測造成該差異的原因可能是各大鼠對藥物的皮膚屏障作用以及皮膚代謝和皮膚清除作用不一致，而非微透析技術(shù)自身缺陷所造成［2］。

［1］ 王小坡，曾 抗，李國鋒，等.UFLC－MS／MS測定大鼠皮下及血液微透析樣品中鬼臼毒素濃度［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，30（6）：1256－1259.

Wang XiaoPo，Zeng Kang，Li GuoFeng，et al.Quantitative determination of podophyllotoxin in dermal and blood microdialysis samples of rats by liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.J South Med Univ，2010，30（6）：1256－1259.In Chinese with English abstract.

［2］ Zhang QuanLong，Hu JinHong，Zhu QuangGang，et al.Development of a novel HPLC－MS／MS method for the determi－nation of aconitine and its application to in vitro and rat microdialysis samples［J］.Biomed Chromatogr，2009，23（7）：692－699.

［3］ Tettey－Amlalo R N，Kanfer I.Rapid UPLC－MS／MS method for the determination of ketoprofen in human dermal microdialysis samples［J］.J Pharm Biomed Anal，2009，50（4）：580－586.

［4］ Zheng Hong，Chen GuangChun，Shi LiFu，et al.Determination of oxymatrine and its metabolite matrine in rat blood and dermal microdialysates by high throughput liquid chromatography／tandem mass spectrometry［J］.J Pharm Biomed Anal，2009，49（2）：427－433.

［5］ Sood P，Cole S，F(xiàn)raier D，et al.Evaluation of metaquant microdialysis for measurement of absolute concentration of amphetamine and dopamine in brain：a viable method for assessing pharmacokinetic profile of drugs in the brain［J］.J Neurosci Methods，2009，185（1）：39－44.