瑞舒伐他汀鈣通過(guò)下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)抑制斑馬魚(yú)血管發(fā)育

呂 慧，王國(guó)坤，劉 博，李松華，秦永文（第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海200433）

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)（percutaneous coronary intervention，PCI）對(duì)心絞痛及心肌梗死的再血管化治療具有重要作用，但術(shù)后支架內(nèi)再狹窄（in－stent restenosis，ISR）一度成為支架植入的障礙。曾有文獻(xiàn)報(bào)道可明顯減少I(mǎi)SR的藥物洗脫支架的再狹窄率在糖尿病病人中高達(dá)20.9%，即使在非糖尿病病人中也達(dá)到14.6%［1］。他汀類(lèi)藥物可抑制人體膽固醇生物合成，在心血管疾病中廣泛應(yīng)用于治療高膽固醇血癥，發(fā)揮穩(wěn)定斑塊、抗炎等作用。既往已有研究表明，他汀類(lèi)藥物可明顯減少PCI后再狹窄率的發(fā)生［2］，而內(nèi)皮細(xì)胞的活化及血管新生在ISR的病理生理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［3］，推測(cè)他汀類(lèi)藥物可能影響血管新生過(guò)程發(fā)揮心血管保護(hù)作用。

為能實(shí)時(shí)活體觀(guān)察他汀類(lèi)藥物對(duì)血管新生的影響，作者使用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。通過(guò)研究瑞舒伐他汀鈣對(duì)斑馬魚(yú)血管發(fā)育的影響，間接揭示他汀類(lèi)藥物影響血脂之外的作用，為血管新生相關(guān)PCI后再狹窄的治療提供新的參考。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 動(dòng)物模型為轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg（flk1：EGFP），系中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院饋贈(zèng)；Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；PrimeScript RT試劑盒（日本Takara公司）；雷鳥(niǎo)定量PCR試劑（日本Toyobo公司）；體視熒光顯微鏡（德國(guó)萊卡儀器有限公司）。瑞舒伐他汀鈣片（10mg／片，批號(hào)113651，阿斯利康制藥公司）。

1.2 藥物溶液制備 根據(jù)Westerfield［4］方案配制魚(yú)卵水（egg water，137mmol／L NaCl，5.4mmol／L KCl，0.13mmol／L CaCl2，0.1mmol／L Mg2＋，pH 7.2），將瑞舒伐他汀鈣片研磨成粉后溶入二甲亞砜（DMSO）終濃度為0.5%的魚(yú)卵水中，藥物濃度梯度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.10nmol／L。

1.3 胚胎處理 根據(jù)Westerfield［4］方案飼養(yǎng)，28.5℃下照明14h／黑暗10h為一個(gè)周期，飼養(yǎng)水連續(xù)充氧氣，水為半自動(dòng)更新，定時(shí)給予飼料草履蟲(chóng)。取卵前1d，雌雄斑馬魚(yú)以1／2的比例放入交配缸內(nèi)，交配缸底部有產(chǎn)卵托盤(pán)，中間放置隔板，過(guò)夜，次日晨照明后去掉隔板1h內(nèi)取胚胎。使用24孔板，每孔中至少20個(gè)胚胎，加入不同濃度的藥物，形成藥物的不同濃度梯度。從受精卵形成后0.5h開(kāi)始刺激，持續(xù)24h。受精后24h觀(guān)察斑馬魚(yú)的血管發(fā)育情況。實(shí)驗(yàn)組每孔加入上述不同濃度藥物2ml，對(duì)照組每孔加入含0.5%DMSO的魚(yú)卵水。

1.4 定量聚合酶鏈反應(yīng) 使用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT－PCR），檢測(cè)不同時(shí)期胚胎血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF－A）的表達(dá)量。以管家基因甘油醛－3－磷酸脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，根據(jù)斑馬魚(yú)GAPDH和VEGF－A基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。GAPDH及VEGF－A的引物分別為：VEGF－A F：5′－CGAAACGTCACTATGGAGGTG－3′；VEGF－A R：5′－GCAAGGCTCACAGTGGTTTT－3′；GAPDH F：5′－CAGGCATAATGGTTAAAGTTGGTA－3′；GAPDH R：5′－CATGTAATCAAGGTCAATGAATGG－3′。按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)操作，分別提取0、6、12和24h斑馬魚(yú)胚胎總RNAs，使用PrimeScript RT試劑盒將總RNAs反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將所得的cDNA產(chǎn)物置于－20℃保存。以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA體積的1／20為模板，使用雷鳥(niǎo)定量PCR試劑行定量PCR。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性1min，94℃變性20s，58℃退火20s，72℃延伸15s，40個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育10min。建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線(xiàn)，以鑒定產(chǎn)物是否單一。擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，采用Rotor Gene 6軟件進(jìn)行VEGF－A與GAPDH基因條帶的相對(duì)密度分析。數(shù)據(jù)分析采用2—△△ct的方法。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)算被抑制的節(jié)間血管的數(shù)目，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS14.0對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中節(jié)間血管異常的斑馬魚(yú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)計(jì)算組間差異，P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 瑞舒伐他汀鈣可抑制斑馬魚(yú)血管發(fā)育 使用0.01、0.02、0.04、0.08、0.10nmol／L 5個(gè)不同濃度的瑞舒伐他汀鈣處理斑馬魚(yú)胚胎，發(fā)育至受精后24hours post fertilization（hpf）。使用熒光顯微鏡觀(guān)察5個(gè)藥物濃度下胚胎的新生節(jié)間血管（intersegmental vessels，ISVs）生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)0.08nmol／L的藥物處理后ISVs較對(duì)照組生長(zhǎng)速度明顯受到抑制，多數(shù)表現(xiàn)為節(jié)間血管長(zhǎng)度較對(duì)照組明顯減少或缺失（如圖1所示）。通過(guò)軟件計(jì)算上述5個(gè)濃度組藥物處理后胚胎的ISVs長(zhǎng)度分別為：（0.045±0.002）、（0.042±0.001）、（0.041±0.001）、（0.028±0.002）、（0.031±0.001）mm，與對(duì)照組（0.050±0.001）mm相比，5個(gè)濃度藥物處理后的胚胎節(jié)間血管長(zhǎng)度均有減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 兩組斑馬魚(yú)胚胎在受精后24h時(shí)節(jié)間血管生長(zhǎng)情況Figure 1 The growth of intersegmental vessels of zebrafish embryos at 24hours post fertilization in the two groups

2.2 瑞舒伐他汀鈣可抑制受精后24h胚胎VEGF－A的表達(dá) 選取斑馬魚(yú)胚胎最初生長(zhǎng)的4個(gè)時(shí)期，即受精后0、6、12和24hpf，觀(guān)察藥物對(duì)血管抑制效果最強(qiáng)的濃度，即0.08nmol／L的瑞舒伐他汀鈣處理胚胎后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)VEGF－A的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組胚胎VEGF－A表達(dá)量均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，同時(shí)，與同時(shí)期對(duì)照組相比，0、6、12hpf實(shí)驗(yàn)組的VEGF－A表達(dá)量未見(jiàn)明顯降低，而在24hpf的表達(dá)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩組不同時(shí)期斑馬魚(yú)胚胎血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A的相對(duì)表達(dá)量Table 1 Relative expression quantity of vascular endothelial growth factor A at different time of zebrafish embryos in the two groups（n＝4，±s）

表1 兩組不同時(shí)期斑馬魚(yú)胚胎血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A的相對(duì)表達(dá)量Table 1 Relative expression quantity of vascular endothelial growth factor A at different time of zebrafish embryos in the two groups（n＝4，±s）

＊P＜0.05，與相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組比較

組別 0hpf 6hpf 12hpf 24hp f對(duì)照組 1.062± 0.0050.002實(shí)驗(yàn)組 1.071± 0.007 1.341± 0.002 2.282± 0.006 3.315± 1.349± 0.001 2.171± 0.011 2.607± 0.020＊

3 討 論

ISR是PCI后的主要不良事件，它與手術(shù)引起的血管損傷相關(guān)，多種因素如血栓形成、炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞外間質(zhì)形成等均參與其病理生理過(guò)程［5］。既往數(shù)十年，已有多項(xiàng)隨機(jī)的回顧性研究表明，他汀類(lèi)藥物較對(duì)照組可顯著減少PCI后6個(gè)月血管再狹窄的發(fā)生率［6，7］。本研究結(jié)果表明，瑞舒伐他汀鈣可明顯抑制斑馬魚(yú)胚胎血管新生，與Walter等［6］的研究結(jié)果一致，從一定程度上反映出他汀類(lèi)藥物對(duì)PCI后再狹窄的預(yù)防作用。

斑馬魚(yú)作為研究脊椎動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有胚胎透明、產(chǎn)卵量大、便于觀(guān)察等特點(diǎn)，同時(shí)其血管生成過(guò)程與脊椎動(dòng)物具有高度保守性。目前使用的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)攜帶特定啟動(dòng)子與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因相連，方便使用熒光顯微鏡觀(guān)察血管發(fā)育。

瑞舒伐他汀鈣抑制血管增生的作用通路尚不明確，通過(guò)行實(shí)時(shí)定量RT－PCR，作者檢測(cè)了斑馬魚(yú)整胚VEGF－A的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)照組可見(jiàn)VEGF－A呈明顯上升趨勢(shì)，早期（0～6hpf）VEGF－A沒(méi)有明顯升高，且本身表達(dá)量較少，12hpf后斑馬魚(yú)VEGF－A表達(dá)量增多，表明在斑馬魚(yú)血管發(fā)育期間，VEGF－A發(fā)揮了重要作用，與Liang等［8］的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，藥物處理后的胚胎VEGF－A的表達(dá)量雖呈上升趨勢(shì)，但較對(duì)照組在24hpf時(shí)的表達(dá)量明顯減少，表明藥物可能影響整個(gè)胚胎VEGF－A的表達(dá)，而節(jié)間血管作為血管發(fā)育的明顯標(biāo)志，表現(xiàn)為長(zhǎng)度的明顯減少。既往研究表明，斑馬魚(yú)的VEGF－A基因與人類(lèi)相似［9］，因此可合理推測(cè)臨床使用瑞舒伐他汀鈣可減少病人VEGF－A的表達(dá)而發(fā)揮預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的作用。但是，目前的研究結(jié)果僅為藥物作用的初步研究，同時(shí)研究結(jié)果表明，瑞舒伐他汀鈣抑制血管新生后可能影響PCI后血管損傷后的新生血管修復(fù)，或影響早期動(dòng)脈粥樣硬化表面纖維帽的穩(wěn)定性而導(dǎo)致斑塊易破裂。目前的數(shù)據(jù)仍然支持他汀類(lèi)藥物應(yīng)用于預(yù)防斑塊形成及支架內(nèi)再狹窄［10］。本研究可為他汀類(lèi)藥物抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗腫瘤作用提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)為他汀類(lèi)藥物在抗血管新生方面的爭(zhēng)議提供依據(jù)。

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